加米霉素注射液在猪体内残留消除研究

邓菲 段鹏 孙晓蒙

(华北制药集团动物保健品有限责任公司，石家庄 050041)

加米霉素(gamithromycin)属氮杂内酯类抗生素，是由法国梅里亚((MERIAL)公司研发的最新动物专用大环内酯类半合成抗生素[1]。2008年，加米霉素注射液首次在欧盟被批准用于治疗溶血曼氏菌、多杀巴氏菌、睡眠嗜组织菌等引起牛呼吸系统疾病(BRD)。

为了打破国外对国内加米霉素的垄断地位，华北制药集团动保公司成功仿制出加米霉素注射液，经过大量的试验研究证明，本产品除了可以治疗牛的BRD外，也可以防治由胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血菌及链球菌引起的猪呼吸系统疾病(SRD)，其在靶动物体内具有吸收快、分布广、安全高效、残留低等特点[2-6]。为了更深一步了解国产加米霉素注射液在猪体内残留时间。因此，本试验旨在通过对猪注射加米霉素，探讨其在猪体内的残留消除时间，以期为科学制定休药期，指导合理临床用药，保障动物源性食品安全提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验药品与试剂

加米霉素注射液，含量150mg/mL，批号：GMM03-1-GMM2，由华北制药集团动物保健品有限责任公司提供；加米霉素对照品(加拿大TRC公司，含量≥99.0%)；加米霉素-D5对照品(加拿大TRC公司，含量≥94.0%)；乙腈、甲醇、甲酸为色谱级(德国Merck公司)；MCX固相萃取柱(Waters公司，60mg3/mL)。

1.2 仪器和设备

液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源(美国Waters公司)；BS-201S型电子天平(北京赛多利斯公司)；DC12H型氮吹仪(上海安谱科学仪器有限公司)；3K30型低温高速离心机(德国Sigma公司)；WH-3型微型旋涡混匀仪(上海沪西分析仪器厂)；24通道固相萃取装置(上海安谱科学仪器有限公司)。

1.3 主要试液配制

加米霉素标准储备液(50μg/mL)：精密称取加米霉素对照品2.5mg，于50mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，混匀即得(-20℃保存)。

加米霉素标准工作液(10μg/mL)：精密量取50μg/mL的加米霉素标准储备液20mL，于100mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，混匀即得(4℃保存)。

加米霉素-D5标准储备液(10μg/mL)：精密称取加米霉素-D5对照品1mg，于100mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，混匀即得(-20℃保存)。

加米霉素-D5标准工作液(1μg/mL)：精密量取10μg/mL的加米霉素-D5标准储备液10mL，于100mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，混匀即得(4℃保存)。

1.4 试验动物及饲养管理

试验实施时间为2016年9月10日—2016年10月14日，试验场地为南京市某猪场。选取体质健康，体重(60±4.3)kg，并在试验前2周未使用抗生素治疗的28头二元猪(雌雄各半)，随机分为2组，对照组4头，试验组24头。试验组猪单次颈部肌注射加米霉素(6mg/kg B.W.以加米霉素计)，对照组不做处理，试验期35d。各组常规饲养并饲喂相同日粮及饮水。

1.5 样品采集及处理

猪注射后，分别在第0.5天、7天、14天、21天、28天和35天时，采集肌肉、肝脏、肾脏、皮脂及注射部位肌肉。对照组猪在试验7d时宰杀；各时间段，随机剖杀4头试验猪进行采样。收集的组织保存于-20℃冰箱中，待测加米霉素残留指标[7]。

1.6 试验方法

加米霉素在猪体内残留含量检测方法[8]，采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定。

1.7 数据分析

试验数据采用Excel软件进行处理，数值以平均数±标准差(x±s)表示，并采用WT 1.4休药期软件处理药物浓度-时间数据，计算休药期[9]。

2 结果

2.1 检测方法有效性

加米霉素的标准曲线在2～500μg/kg的浓度范围内呈现良好的线性关系，其曲线方程为：Y=1.11256X-0.208095，相关系数(R2)均大于0.999。该方法各组织最低检测限为2μg/kg；所有组织定量限为5μg/kg。各组织回收率为73%～114%，批内、批间相对标准偏差均小于14.03%。药物回收率及变异系数符合农业部相关规定[10]，表明该方法能够满足加米霉素残留消除规律试验要求。

图1 加米霉素及内标标准溶液特征离子质量色谱图Fig.1 Characteristic ion mass chromatogram of gamithromycin and internal standard solution

图2 猪肾脏空白特征离子质量色谱图Fig.2 Mass chromatogram of porcine kidney

图3 猪肾脏空白添加加米霉素及内标特征离子质量色谱图Fig.3 Chromatogram of characteristic ion for adding gamithromycin and internal standard in swine kidney blank

由图1～3可知，标准溶液色谱图、空白组织以及空白组织添加加米霉素色谱图对照相比发现，待测物在保留时间处无干扰，方法专属性良好。

2.2 组织中药物残留

由表1可知。猪注射加米霉素后，在0.5d时，各个组织均达到最大残留含量，除注射部位肌肉组织外，加米霉素在肾脏中残留量最高，平均(13540.9±581.00)μg/kg；其次为肺脏组织，平均(8142.53±428.12)μg/kg；接着依次为肝脏、皮脂及肌肉，平均残留量为(7634.75±545.15)、(1158.07±231.26)及(1047.98±109.92)μg/kg。随时间的延长，加米霉素在各组织中的残留含量下降，在7d时，下降速度尤为明显，肌肉、皮脂、肝脏、肾脏、注射点及肺脏的残留量分别为(16.13±3.25)、(34.25±5.45)、(200.43±24.92)、(346.9±44.65)、(2092.75±386.42)和(753.5±90.95)μg/kg。之后，猪各组织中加米霉素残留量下降缓慢，基本在28时，各组织均未残留加米霉素。并通过各组织中加米霉素残留量变化确定在动物体内的靶组织为肾脏。

2.3 休药期计算

由表2和图4可知。休药期的计算采用WT 1.4软件，确保有95%的可信限使99%的残留低于最大残留量(MRL)。注射加米霉素后，猪各组织肌肉、皮脂、肝脏、肾脏及注射位点的休药期分别为9.68、24.35、11.62、17.37及26.75d。

表1 注射加米霉素对猪不同组织残留量实测数据(μg/kg)Tab.1 Measured data of injecting gamithromycin on different tissue residues in swine (μg/kg)

表2 注射加米霉素后猪的休药期Tab.2 Swine withdrawal after injection of gamithromycin

3 讨论

据欧洲药物评价委员会(EMEA)研究报道[5]，给试验猪单剂量肌注射加米霉素6mg/kg B.W.；在给药后第1、2、3、5、7、10及15天时，采集肌肉、肝脏、肾脏、脂肪及注射位点肌肉；其研究结果表明，在给药后7、10和15d，肾脏中加米霉素原药浓度分别为0.57、0.14和0.04μg/g，肝脏的分别为0.275、0.05和＜0.010μg/g，肌肉组织的分别为0.06、0.03和0.02μg/g，注射部位分别为0.98、0.52和0.23μg/g，脂肪组织中也呈现相似的消除代谢表型。本试验研究表明，猪注射加米霉素后，在0.5d时，各组织中加米霉素残留量达到最高；随之在一周后，含量迅速锐减下降。本试验与国外同类产品的残留消除结果基本一致。同时本试验研究发现，加米霉素在猪各食性组织中残留量按高低排列依次为，注射部位肌肉＞肾脏＞肺脏＞肝脏＞皮脂＞肌肉；本试验中各组织加米霉素残留量高低同样也与EMEA[5]报导结果相一致。

图4 加米霉素注射液的组织残留消除拟合图Fig.4 Elimination of tissue residues in the injection of gamithromycin

根据参考欧盟EMEA制定的猪MRL标准[1]，其肌肉、皮脂、肝脏及肾脏的最大残留限量分别为100、100、100和300μg/kg。鉴于我国尚未制定加米霉素在猪组织中的最大残留量(MRL)标准。因此，综合WT 1.4休药期软件处理结果，建议国产加米霉素注射液按推荐给药方案，猪的休药期定为27d。但据欧盟兽药委员会(CVMP)公布加米霉素在猪上使用的休药期为16d[5]。本试验统计处理结果与其不一致，可能原因为动物休药期的长短不仅与产品加米霉素密切相关，还与执行的残留限量标准有关。由于各国制定的，动物使用加米霉素(含相同活性成分)残留限量标准有可能不同。因此，即使相同活性成分的加米霉素在不同国家的休药期也存在差异。

4 结论

猪单剂量肌注射国产加米霉素注射液(6mg/kg B.W.)，除注射部位肌肉外，肾脏残留量最高，其次是肺脏、肝脏、皮脂及肌肉。建议猪的休药期为27d。