鼠李糖乳杆菌对头孢曲松引起的幼年期肠道菌群及生长发育异常的改善效果研究

郭佳汶 程如越 张瑜杰 周玮忻 王柯 陈书巧 彭天宇 李鸣 何方

(四川大学华西公共卫生学院营养与食品卫生学及毒理学系，成都 610041)

人体肠道栖息着数量庞大，种类繁多的微生物，其与人体高度共生，构成了复杂的肠道微生态系统。肠道菌群的稳态与人体健康息息相关。近年来，由于抗生素的预防和治疗作用，儿童抗生素暴露率越来越高，抗生素在杀灭病原菌的同时也会部分杀灭一些肠道共生有益菌，从而导致肠道菌群的紊乱。大量研究提示了肠道菌群紊乱与疾病之间有着密切的关系。溃疡性结肠炎是一种慢性结肠炎症，肠道菌群紊乱被认为是影响其进展的重要因素[1]。傅玲琳等[2]从分子及细胞水平出发，阐述了肠道微生物与食物过敏之间的联系。近年来，儿童哮喘发病率增高也普遍认为与肠道菌群失衡有关[3]。本课题组的前期研究也表明头孢曲松可以引起初生小鼠的肠道菌群紊乱，导致受试小鼠的肠道组织发育缺损[4]，影响受试小鼠的免疫系统发育，从而引起小鼠成年后表现出对食物蛋白的易感性。因此，研究改善人类生命早期的肠道菌群失调的方法将成为重要趋势。

益生菌是指能改善肠道微生物平衡，当摄入足够数量时，对宿主有积极的健康功效的一类微生物的总称[5]。研究表明，益生菌具有抑制病原菌促进肠道健康[6]、提高人体免疫力[7]、降低血清胆固醇[8]等功能。目前国际上常用的益生菌主要来自乳酸杆菌和双歧杆菌，其中LGG菌代表的鼠李糖乳杆菌备受关注。已有研究指出鼠李糖乳杆菌具有调节肠道微生物菌群平衡，参与机体免疫稳态，宿主营养物质代谢的生物学功能[9-10]，但其对肠道菌群平衡的具体作用还有待深入研究。

本研究将用头孢曲松和鼠李糖乳杆菌投用幼鼠、详细地分析头孢曲松引起的小鼠幼年期肠道菌群失调、肠管上皮细胞组织及机体损伤、同时深入地探索鼠李糖乳杆菌的改善效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物

36只四周龄大的SPF级Balb/c小鼠，购买于四川省人民医院(四川省医学科学院)实验动物研究所。饲养于四川大学华西公共卫生学院动物中心IVC系统中。室温(23±1)℃，湿度50%～70%，自由饮食，12h昼夜节律。

1.2 试剂与材料

头孢曲松(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；无水乙醇(成都金山化学试剂有限公司)；粪便细菌DNA提取试剂盒(北京天根生化科技北京有限公司)；鼠李糖乳杆菌GG菌株(Lactobacillus rhamnosus,GG)来自于丹麦科汉森；二代测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 实验流程及分组

36只四周龄大的小鼠适应性喂养3d后被随机分为3组，每组12只，分别为实验组、抗生素组和空白组。实验共计4周。实验组第一周每天灌胃头孢曲松(40mg/d/只)和鼠李糖乳杆菌悬液(109CFU/只)，之后停止干预继续喂养至实验结束。抗生素组为阳性对照组，第一周每天灌胃头孢曲松(40mg/d/只)，之后停止干预。空白组第一周每天灌胃生理盐水，之后停止干预。从实验第一天开始，每3天测一次体重，记录体重增长情况。每周采集小鼠粪便，提取小鼠粪便细菌DNA，qPCR分析粪便总菌群浓度变化。二代测序分析小鼠第一周和第四周粪便菌群结构。实验末期处死小鼠后，比较各组脏器系数以及对各组进行肠道病理学检测。

1.4 组织病理学检测

实验末处死小鼠后，以盲肠为界收集小鼠结肠及回肠各约1cm，10%甲醛固定后做组织切片。HE染色观察回肠及结肠结构。每组内每张切片挑选100倍视野进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0软件以右下角100倍标尺为标准，每张切片选取5根完整的绒毛，分别测量绒毛高度(mm)、肠腺深度(mm)，并作统计学分析。

1.5 粪便DNA提取及细菌定量

每周收集小鼠粪便，共计4次，-80℃冻存。严格遵照粪便基因组DNA提取试剂盒操作步骤提取粪便DNA。qPCR测定小鼠粪便细菌总量。qPCR反应条件如下：95℃预热1min，94℃解链20s，55℃退火20s，72℃延伸50s，共40个循环。根据大肠埃希菌标准曲线计算粪便样品的细菌浓度，具体实验方法参考之前的研究[11]。

1.6 二代测序

琼脂糖凝胶电泳检测待测序DNA的纯度和浓度，并进行文库构建，使用HiSeq进行上机测序，之后基于有效数据进行OTUs聚类和物种分类分析。具体实验方法参考之前的研究，并做部分修改[4]。

1.7 统计学分析

采用GraphPad Prism 7.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料用(均数±标准差)(±s)表示，组间均数比较符合正态用方差分析；不符合正态采用wilcoxon秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠体重变化

每3d测量1次体重，见图1。投用抗生素后，与空白组相比，实验组和抗生素组小鼠体重增长均减缓，第3、6、9天实验组和抗生素组体重均低于空白组(P＜0.05)。实验组于12d体重与空白组差异无统计学意义，抗生素组于21d体重与空白组相比差异无统计学意义。实验组体重恢复比抗生素组快。

2.2 3组脏器系数比较

实验末处死小鼠后计算每只小鼠的肝脏脏器系数，由图2可知，抗生素组低于空白组和实验组(P＜0.01)(图2)。

2.3 肠组织病理检测

第四周3组回肠绒毛细长排列整齐，结肠隐窝明显(图3)。抗生素组回肠肠腺深度低于空白组(P＜0.05)，而实验组与抗生素组和空白组均无统计学差异(图4)。

2.4 粪便细菌浓度分析

图1 3组小鼠随年龄增长的体重变化Fig.1 Body weight of mice in three groups

图2 3组肝脏脏器系数比较 Fig.2 Liver index of mice in three groups

投用抗生素后，实验组和抗生素组第一周和第二周粪便细菌浓度均显著低于空白组(P＜0.05)。第四周实验组粪便细菌浓度低于抗生素组和空白组(P＜0.05)(表1)。

2.5 肠道菌群多样性分析

图3 3组回肠及结肠的病理组织切片(苏木精-伊红染色，×100)Fig.3 Intestinal tissues morphologic development of mice in three groups

图4 3组回肠及结肠绒毛长度、肠腺深度 Fig.4 The depth of crypt in ileum of mice in three groups

等级聚类曲线(rank abundance)以OTUs的排序编号为横坐标，OTUs中的相对丰度为纵坐标。曲线在横轴上的跨度越大，其物种丰富度越高，垂直方向曲线越平滑表示样本的物种分布越均匀。由图5可知，第一周投用抗生素后，实验组和空白组的物种丰富度和均匀度相似，而抗生素组物种丰富度大于实验组和空白组。停止抗生素干预，第四周3组曲线走向一致，物种丰富度和均匀度相似。

Alpha多样性通常用于分析各组内微生物群落多样性，是反映丰富度和均匀度的综合指标。Shannon指数和Simpson指数都是用来估算样品中微生物多样性指数之一。其值越大，说明群落多样性越高。抗生素投用一周后，实验组和抗生素组的Shannon指数，Simpson指数均显著降低(P＜0.05)(表2)。相较于抗生素组，实验组的Shannon指数，Simpson指数有增高趋势。第一周实验组和抗生素组的Shannon指数及Simpson指数显著降低表明，抗生素的投用降低了受试小鼠肠道菌群多样性，引起了肠道菌群紊乱。停止干预3周后，抗生素组的Shannon指数、Simpson指数均显著地高于空白组和实验组，实验组的Simpson指数与空白组差异无统计学意义，说明抗生素造成的肠道菌群紊乱在抗生素停用3周内无法完全得到自然恢复、同时使用鼠李糖乳杆菌有利于紊乱的肠道菌群恢复到正常水平。3组样品的goods_coverage均在0.99以上，表明样品测序深度足够，覆盖率高。

表1 粪便细菌浓度 (log10 CFU/g)Tab.1 Fecal bacteria concentration of mice in three groups

图5 3组等级聚类曲线比较 Fig.5 Rank abundance of three groups

表2 各组粪便样品群落多样性比较Tab.2 Fecal bacteria diversity analysis of three groups

2.6 小鼠肠道菌群组成分析

Venn图是根据OTUs聚类分析结果制成，可用于分析不同组间共有及特有的OTUs。由图6可知，第一周抗生素干预后，3组共有物种有221种，其中空白组和实验组的特有物种分别为59种和69种，而抗生素组有680种特有物种。抗生素组特有物种显著高于空白组和实验组，表明单独使用抗生素后原本优势菌群可能受到抑制，使某些原本处于抑制状态的菌种(多数为条件致病菌)异常生长。停止干预3周后，3组共有物种增加到283种，此时空白组有152种特有物种，而实验组和抗生素组分别有60种和79种。

图6 各组小鼠粪便样品Venn图Fig.6 Venn graph of three groups

图7 门水平上的物种相对丰度柱形图Fig.7 OUT relative abundance of three groups at the phylum level

观察3组门水平上的群落结构组成情况(图7)。第一周，空白组主要为厚壁菌门(37.78%)和拟杆菌门(60.75%)。而实验组和抗生素组主要为厚壁菌门。停止干预3周后，空白组依旧以厚壁菌门(45.58%)和拟杆菌门(53.54%)为主。此时实验组和抗生素组的厚壁菌门有所减少，实验组肠道中以厚壁菌门(56.78%)、拟杆菌门(28.83%)和疣微菌门(13.99%)为优势菌；抗生素组菌群相对丰度依次为厚壁菌门(63.38%)、拟杆菌门(22.57%)和疣微菌门(13.53%)。组间差异物种分析，门水平上第一周实验组有3类菌群与空白组差异有统计学意义，抗生素组有7类菌群。停止干预3周后实验组有2类菌群相对丰度与空白组存在差异，而抗生素仍有4类菌群。从属水平上看(图8)，第一周实验组Lactobacillus属的相对丰度高于抗生素组和空白组，但停止投用鼠李糖乳杆菌悬液后，第四周实验组Lactobacillus属相对丰度明显减少。组间差异物种分析，第四周抗生素组Parasutterella、Alistipes、Parabacteroides属的相对丰度大于空白组，而实验组与空白组无差异。实验组Lactobacillus属相对丰度显著小于空白组和抗生素组(P＜0.05)。

主坐标分析(PCoA)是通过一系列的特征值和特征向量排序从多维数据中提取出最主要的元素和结构。横坐标表示一个主成分，纵坐标表示另一个主成分，百分比表示主成分对样本差异的贡献值；图中每个点表示一个样本，同一组的样本使用同一种颜色表示。样本距离越接近，表示物种结构越相似，因此群落结果相似度高的样本倾向于聚集在一起，群落差异很大的样本则会远远分开。由图9可知，第一周的实验组和空白组以及第四周的3组能聚集在一起，群落结果相似度高。而第一周的抗生素组样本与其他组远远分开，群落差异较大。

3 讨论

近年来，人们对抗生素的副作用日益关注，尤其是其对儿童青少年的影响。有研究表明抗生素对正常成年人肠道菌群的影响是短暂可逆的，但由于生命早期是机体肠道菌群更替成熟的特殊时期，抗生素对儿童青少年的影响更加深远更加长久[12]。抗生素在现代医疗中占有举足轻重的作用，因此寻找改善抗生素引起的肠道菌群失调的方法至关重要。本实验用头孢曲松持续灌胃四周龄小鼠一周，造成生命早期肠道细菌群紊乱模型并使用益生菌干预，研究益生菌对菌群紊乱的改善效果。

图8 属水平上的物种相对丰度柱形图Fig.8 OUT relative abundance of three groups at the genus level

图9 3组主坐标分析(PCoA) Fig.9 Principal co-ordinates analysis of three groups

研究结果表明，实验18d及之前抗生素组的体重低于空白组，表明抗生素对幼鼠体重增长有负面作用。停止干预后，益生菌组体重恢复速度快于抗生素组。体重的增长与机体的营养摄入有关，肠道是机体消化吸收的重要部位。肠黏膜形态结构的完整性是肠道发挥功能的基础保障，绒毛高度、隐窝深度是反映肠黏膜形态结构完整性的重要指标。比较3组肠道病理形态，结果显示，抗生素组隐窝深度低于空白组，证实了抗生素对肠道形态学的影响，这与之前的研究一致[4]。而实验组与空白组差异无统计学意义，说明益生菌的投用能一定程度上逆转抗生素所引起的肠道黏膜结构的改变。肝脏具有代谢解毒的功能，是新陈代谢的重要器官，肝脏脏器系数比较，抗生素组低于空白组和实验组，也说明了抗生素对机体的损害作用和益生菌的恢复作用。

肠道微生物和机体是一种相互依存相互制约的关系，当微生态处于平衡状态时，肠道内正常微生物菌群对肠道的结构和功能起着至关重要的作用[13]。本研究中抗生素干预一周后，抗生素组和实验组的受试小鼠粪便菌群总量均显著低于空白组，停止干预后受试小鼠粪便细菌浓度迅速增长。空白组粪便细菌浓度从第一周到第四周均数逐渐降低，第四周粪便细菌浓度低于第一周，表明随着年龄的增长，粪便细菌浓度有一个降低的过程。第四周，实验组受试小鼠粪便细菌浓度低于空白组和抗生素组，说明鼠李糖乳杆菌样的益生菌早期干预可能会以某种方式影响粪便细菌的增殖，甚至低于自然恢复的抗生素组。

等级聚类曲线能直观的反映3组粪便细菌的物种丰富度和均匀度。实验结果显示，抗生素干预一周后，抗生素组曲线平滑横轴跨度大，与空白组相比差异较大，表明抗生素对菌群的紊乱作用；实验组益生菌干预后，与空白组曲线走向相似，说明就物种丰富度和均匀度来看，在抗生素紊乱肠道菌群的同时投用益生菌，有利于肠道菌群的平衡。第四周，3组曲线走向相似，表明即使不使用益生菌干预，机体也有一定的自愈能力。但在抗生素紊乱的同时给与益生菌改善治疗有利于机体肠道菌群及时恢复。另外，第4周实验组的Simpson指数与空白组无差异，抗生素组Simpson指数高于空白组和实验组；Shannon指数比较，抗生素最高，实验组次之，空白组最低。这些结果也表明了抗生素对菌群的紊乱作用和益生菌对其的改善效果。研究结果可以看出相较于空白组第一周抗生素组物种丰富度增高，物种分布更均匀，4周后抗生素组肠道菌群多样性更高。抗生素的使用引起菌群多样性提高有可能是由于投用抗生素抑制了优势菌群的生长，使原来被抑制的微量存在的菌种(其中不少属于条件病原菌)异常生长，可能会有害宿主健康，这种变化甚至在抗生素停止使用仍在继续。本研究结果表明抗生素导致肠道菌群的异常不仅表现在抗生素投用期间而且持续到生命的后期。现有研究大多把物种分布均匀，丰富度及多样性增高看作是衡量菌群健康的标志，此次结果也说明今后在研究时不能仅以菌群丰富度、均匀度或多样性作为衡量菌群稳态的标志，需参考其他信息综合评判。

肠道菌群组成分析，在分类学门水平上无论是第一周还是第四周，实验组与空白组的差异均小于抗生素组与空白组的。属水平上，第四周抗生素组Parasutterella、Alistipes、Parabacteroides的相对丰度大于空白组，而实验组与空白组无差异。Chen等[14]认为Parasutterella的丰度与肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)呈正相关关系；而Alistipes丰度与IBS患者腹部疼痛次数相关[15]，并且与体重、血脂水平呈正相关[16]。Parabacteroides作为条件致病菌具有一定的耐药性与多种感染性疾病有关[17]。投用鼠李糖乳杆菌GG株菌悬液后，第一周Lactobacillus作为实验组的优势菌群，相对丰度明显高于抗生素组和空白组，然而停止干预后第四周实验组Lactobacillus的相对丰度低于空白组和实验组，表明在抗生素紊乱肠道菌群的同时投用益生菌，可能会干扰益生菌的定植，使Lactobacillus的相对丰度甚至不如自然恢复的抗生素组。但益生菌的投用对菌群多样性有所改善，说明单独投用一种菌可能并不能使这种菌成为优势菌，而是通过某种方式改善了菌群结构，其改善机制可能还需要进一步的研究。

主坐标分析比较3组微生物群落构成，以期发现不同组间的差异。结果显示第一周抗生素组聚类不如实验组，说明在抗生素干预的同时使用益生菌干预能帮助宿主迅速建立正常的菌落结构，有效改善抗生素诱导的肠道菌群紊乱。尽管4周后3组群落结果相似度高，表明不使用益生菌机体肠道菌群自行也能恢复，但菌群群落结构恢复不如实验组及时。

综上，本研究证明生命早期投用抗生素能显著影响体重及肠道组织发育，抗生素引起的菌群紊乱可能是机制之一。在抗生素干预的同时投用益生菌能有效抑制某些菌群的生长，使肠道菌群结构尽量保持稳定，在一定程度上改善抗生素对机体的损伤作用。