血流感染CRKP的临床特点及高毒力血清型分析

付玉冰 董爱英,* 汪亚斯 张嫘 黄军祉 周海健

(1 华北理工大学附属医院，唐山 063000；2 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206)

肺炎克雷伯菌是临床常见的医院感染条件致病菌，可导致肺炎、败血症、肝脓肿等多种感染[1]。随着碳青霉烯类药物越来越广泛的应用，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(carbapenemresistantKlebsiella pneumoniae, CRKP)呈逐年上升趋势，使抗生素选择性压力愈加严重，增加了患者的治疗难度且死亡率较高。近年来，国内外对新出现的高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiella pneumoniae,hvKP)的研究报道有很多，而对于hvKP菌血症的相关报道却并不多见。由于我院近期CRKP血流感染死亡率的大幅提升，给临床工作带来了很大的困扰，因此本研究旨在了解我院CRKP血流感染患者的临床特征，分析CRKP高毒力血清型的分布情况，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

连续收集我院2016年11月—2017年9月临床血培养标本中分离出的肺炎克雷伯菌，筛选出CRKP 22株(同一患者分离的相同菌株不重复记录)。

1.1.2 主要仪器和试剂

Phonenix-100全自动细菌鉴定/药敏系统及配套试剂由美国BD公司生产；PCR扩增仪由德国Eppendorf公司生产；电泳仪由美国BioRad公司生产；PCR试剂由上海生物工程有限公司生产；培养基和替加环素MIC测试条由温州康泰生物科技有限公司生产；药敏纸片由英国Oxoid公司生产。

1.1.3 质控菌株

大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853和金黄色葡萄球菌ATCC25923为药敏质控菌株；肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705为改良Hodge试验阳性对照菌株、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706为改良Hodge试验阴性对照菌株。质控菌株均购自温州市康泰生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定及药敏试验

采用美国BD公司生产的Phonenix-100全自动细菌鉴定/药敏系统、联合纸片扩散法(K-B法)进行菌株鉴定和药敏试验。替加环素药敏试验方法为E-test法。药敏结果判读参照美国临床实验室标准化研究协会(CLSI)M100-S26文件2017年推出的判读标准[2]。

1.2.2 表型检测

采用改良Hodge试验筛查碳青霉烯酶表型，EDTA协同试验筛查金属β-内酰胺酶。

1.2.3 PCR检测khe基因、耐药基因及血清型

煮沸法制备DNA模版，采用PCR方法扩增肺炎克雷伯菌的体外溶血酵素基因khe，2种常见耐药基因(blaKPC、blaIMP)和6种高毒力血清型(K1、K2、K5、K20、K54和K57)。PCR引物见表1，反应体系和反应条件见参考文献[3-4]。PCR扩增产物经基因测序后与GenBank基因库中的已知序列进行Blast比对。

2 结果

2.1 表型确认试验

改良Hodge试验结果显示，22株CRKP均为阳性，阳性率为100.0%。

2.2 khe基因检测

用PCR方法筛选肺炎克雷伯菌体外溶血酵素基因(khe)，结果均为阳性。图1表明血培养标本分离到的菌株均为肺炎克雷伯菌。khe扩增条带大小为428bp，与理论值相符。

2.3 耐药基因检测

PCR扩增结果见图2，22株CRKP中有17株携带blaKPC基因，检出率为77.3%，未检出blaIMP基因。

2.4 高毒力血清型检测

2.4.1 PCR基因扩增及序列对比

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，通过凝胶成像仪可见待测菌株的目的基因条带，结果见图3。PCR扩增产物经基因测序后与GenBank基因库中的已知序列进行Blast比对。

2.4.2 高毒力血清型检出情况

22株CRKP有5株检出高毒力血清型，检出率为22.7%。其中K1型1株，占4.5%；K5型2株，占9.1%；K20型2株，占9.1%。

表1 细菌PCR靶标与引物Tab.1 Primers used in this study

图1 临床肺炎克雷伯菌khe基因PCR扩增结果Fig.1 Results of PCR amplification of khe gene

图2 耐药基因PCR扩增结果Fig.2 Results of PCR amplification of drug resistant gene

2.4.3 高毒力CRKP菌株分布及临床特点

图3 高毒力血清型PCR扩增结果Fig.3 Results of PCR amplification of hypervirulent serotypes

我院2016年11月—2017年9月共检出血流感染CRKP22例，其中有5例存活，17例死亡，死亡率达77.3%。患者平均年龄为66岁，平均住院时间为28d，有导管留置或使用呼吸机的患者占59.1%。患者多有较重的心脑血管疾病或呼吸系统疾病等，科室分布主要在重症医学科(59.1%)，神经内科重症病房(22.7%)，泌尿外科(9.1%)，血液科(4.5%)等。PCR扩增结果显示，22株CRKP有5株检出高毒力血清型，并且主要分布在不携带blaKPC基因的菌株中，其中K1型1株，为不产KPC菌株；K5型2株，均为不产KPC菌株；K20型2株，有一株为不产KPC菌株。检出高毒力CRKP菌株的患者死亡率为80.0%。具体情况见表2。

2.4.4 CRKP菌株毒力与耐药情况

将5株毒力菌株与17株非毒力菌株的药敏结果进行比较，结果见表3。22株CRKP对亚胺培南和美罗培南的耐药率为100%，对替加环素和多黏菌素完全敏感，毒力菌株与非毒力菌株对复方磺胺甲噁唑的耐药率差别不大，分别为60.0%和52.9%，但对阿米卡星和庆大霉素的耐药率差别较大，表现为毒力菌株对氨基糖苷类抗生素的耐药率更低。

表2 高毒力CRKP菌株分布及临床特点Tab.2 The distribution of hypervirulent serotype and clinical characteristics of CRKP

表3 CRKP菌株毒力与耐药情况Tab.3 The hypervirulent serotypes andresistance of CRKP

3 讨论

目前，CRKP引起的血流感染已经较为常见，并且主要是医院获得性感染，特别是在重症监护病房，因患者病情危重，免疫力低下，一旦发生导管留置易引起导管相关血流感染，治疗困难且死亡率较高[5]。在本次研究中，CRKP患者的病区主要分布在重症医学科(59.1%)，神经内科重症病房(22.7%)，泌尿外科(9.1%)，血液科(4.5%)等，患者年龄偏大，住院时间较长，有心脑血管疾病或呼吸系统疾病等。在22例CRKP血流感染的患者中，有5例存活，17例死亡，死亡率达77.3%，死亡的患者大多采用了中心静脉导管、呼吸机等有创操作。由美国CDC2013年公布的数据显示，碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌引起的血流感染死亡率达50.0%，约6.5%的患者死于CRKP[6]，由此可见我院CRKP血流感染的死亡率较高，是威胁患者生命的重要危险因素。

khe基因仅存在于肺炎克雷伯菌中，编码大小为19kDa的蛋白，可能有溶血素活性，因此可作为鉴定肺炎克雷伯菌的特异性靶标[7]。本研究中的22株肺炎克雷伯菌的khe基因PCR检测结果均为阳性，再次证实了khe基因作为肺炎克雷伯菌标示序列的可靠性。

20世纪80年代，台湾学者首次发现肺炎克雷伯菌性肝脓肿，并提出了hvKP[8]。hvKP毒力的增加主要与荚膜多糖、铁摄取系统及毒力基因有关，其中荚膜多糖是肺炎克雷伯菌的重要毒力因子，可有效介导菌体逃避或抵抗宿主的免疫杀伤和保护细菌免受中性粒细胞的吞噬[9]。根据荚膜多糖(K抗原)分型，可将肺炎克雷伯菌分为82个K血清型，其中K1、K2、K5、K20、K54和K57血清型与人和动物各种侵袭性感染密切相关，被认定为高毒力血清型肺炎克雷伯菌。根据文献报道[10]，wzy_K1、wzy_K2、wzx_K5、wzy_K20、wzx_K54和wzx_K57分别为这6种高毒力血清型的特异性靶基因，因此，本研究根据参考文献[11]合成了相应的引物，利用PCR的方法进行血清型鉴定。结果显示22株CRKP有5株检出高毒力血清型，检出率为22.7%，其中K1型1株(占4.5%)，K5型2株(占9.1%)，K20型2株(占9.1%)，与吴华等[12]报道不相符，其中K1和K2血清型的比例较少，经分析可能与本研究标本量较少或地区差异有关。

Jung等[13]提出细菌为了获得耐药基因以取得最佳适应而丢弃一些毒力因子，因此本研究也关注了细菌毒力与耐药基因之间的关系。依据杨丽君等[14]报道，blaKPC和blaIMP为本地区最主要的耐药基因，因此在本次试验之前已经对这两种耐药基因进行筛查，结果有17株CRKP检出blaKPC基因，未检出blaIMP基因。经研究发现高毒力CRKP主要分布在不携带耐药基因的菌株中，并且有90.0%以上的非毒力菌株携带耐药基因，说明致病力较高的CRKP可能对药物的敏感度更高。另外本试验分离到1株产KPC酶基因的K20菌株，这与张嵘等[15-16]试验结果一致，说明越来越多的研究在CRKP菌株中检出产KPC的高毒力菌株。

毒力菌株与非毒力菌株的药敏结果显示，22株CRKP对碳青霉烯类抗生素的耐药率为100%，对替加环素和多黏菌素完全敏感，毒力菌株与非毒力菌株对复方磺胺甲噁唑的耐药率差别不大，分别为60.0%和52.9%，但对氨基糖苷类抗生素的耐药率差别较大，表现为毒力菌株对氨基糖苷类抗生素更敏感，这与程颖等[17]研究发现的hvKP药物敏感率大于经典肺炎克雷伯菌的说法一致，为两者所引起血流感染的临床用药及预后差别提供了实验室依据。

由此可见，我院血流感染CRKP菌株存在高毒力血清型，提示临床医生应提高对hvKP的注意，重视血流感染的诊治与控制，为患者提供良好的就医环境。本次研究的标本量较少，使试验结果存有一定的局限性，因此，本研究下一步计划探究碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌与CRKP的毒力差异、呼吸道感染与血流感染CRKP的毒力差异，从而更加有针对性地防控和治疗CRKP引起的相关感染。