miRNA-628-3p调控乳腺癌细胞增殖的作用及机制研究*

董文珠，陈杭萍，陈赛贞，夏哲林，章 欣，姚 立△

(1.台州市中心医院药剂科，浙江台州 318000；2.浙江中医药大学药学院研究所，杭州 310053)

乳腺癌是当今最常见的恶性肿瘤，病死率为所有女性恶性肿瘤的第二位，仅次于肺癌[1]。不论是在发达地区还是其他地区，乳腺癌发病率都呈现上升趋势。2016年来自于美国的官方统计数据发现：美国女性中乳腺癌的患病人数达到246 660例，占所有女性癌症患者的29.00%，高居所有癌症的榜首，其死亡人数达到40 450例，占总死亡人数的14.00%。美国国家肿瘤研究所预测，每个女性至少有13.20%的风险患乳腺癌[2-4]。尽管乳腺癌治疗在现代技术的发展中已经取得了诸多成就，但乳腺癌背后的分子机制仍是癌症研究领域的焦点。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类由非蛋白编码基因转录物形成的茎环结构前体，剪切成熟后形成的长度为20～25 nt的小RNA分子，与其他蛋白质编码基因mRNA转录本反向互补，由DNA转录产生，但并不翻译成蛋白质，而是通过调节其他基因的功能来影响目标蛋白的合成，miRNA生物学效应广泛，对个体发育、细胞分化、增殖和凋亡等生理调控起着重要的作用[5]。研究表明，超过50%的编码基因位于与肿瘤相关的基因位点，这说明可能在肿瘤的发生、发展中扮演重要角色[6]。ZENG等[7]发现，miRNA-133b能够通过靶向调控表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)，进而抑制食管鳞状癌细胞的增殖、迁移和侵袭。YANG等[8]发现，miRNA-20a和miRNA-486是结肠癌潜在的肿瘤标志物。目前已有研究表明miRNA-628-3p在胃癌中表达，且与其癌旁配对正常组织相比表达降低[9-10]；并有研究指出上调miRNA-628-3p的表达能够促进胃癌细胞凋亡，抑制细胞增殖[11]。然而，miRNA-628-3p在乳腺癌当中的作用及机制并未明确。因此，本文旨在研究miRNA-628-3p对乳腺癌细胞增殖作用的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)与乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231)购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2试剂 DMEM/F-12(1∶1)、胎牛血清购自美国Hyclone公司；青霉素-链霉素购自杭州吉诺生物医药技术有限公司；霍乱霉素、胰岛素、氢化可的松、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天公司； Trizol、反转录试剂盒Prime Script RT Reagent Kit 和SYBR Prime Script miRNA RT-PCR Kit购自日本Takara公司；miR-628-3p模拟物(miR-628-3p mimic)和多聚腺苷酸结合蛋白互作蛋白1(PAIP1)-siRNA转染试剂Lipofectamine 2000 Transfection购自山东维真生物科技有限公司；一抗(PAIP1，GAPDH)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗购自美国Cell Signaling Technology公司；电化学发光(ECL)显影液购自美国Bio-Rad公司。

1.1.3仪器 MCO-15AC型二氧化碳培养箱购自日本SANYO； Nikon ECLIPSE TT-E型荧光倒置显微镜购自Nikon EclipSE Ti；Bio-Rad电泳仪、Bio-Rad多功能酶标仪和Bio-Rad荧光定量PCR仪均购自美国Bio-Rad公司；Chemiscope 3300min化学发光成像系统购自CLinx Science Instruments。

1.2方法

1.2.1细胞培养 MCF-7、MDA-MB-231细胞株培养于含10%的胎牛血清、青霉素200 U/mL、链霉素200 U/mL的完全培养液DMEM/F12(1∶1)，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。每2天换液1次，待80%～90%融合后，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3传代，置37 ℃、5% CO2培养箱内继续培养，取对数期细胞用于实验。MCF-10A细胞株培养于含5%马血清、胰岛素10 μg/mL、霍乱霉素100 ng/mL、内皮生长因子(ECGS)20 ng/mL、氢化可的松0.50 μg/mL、青霉素200 U/mL、链霉素200 U/mL的完全培养液DMEM/F12(1∶1)。

1.2.2RT-PCR实验检测miR-628-3p表达量 使用Trizol试剂从MCF-7细胞中提取总RNA。按照反转录试剂盒Prime Script RT Reagent Kit和SYBR Prime Script miRNA RT-PCR Kit反转录并进行RT-PCR。miR-628-3p上游引物序是5′-CTT CGA CTG CCA CTC TTA-3′， 5′-TGT CAC TTC CTC ATG CTG-3′为下游引物序列。miR-628-3p内参是U6，U6上游引物序列5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′， 5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′为下游引物序列。

1.2.3miRNA-628-3p mimic、空载体阴性对照(NC)、PAIP1-siRNA及si-NC转染 将miR-628-3p mimic、NC及PAIP1-siRNA干粉用RNase-free水配制成20 μmol/L的母液后分装、冻存备用。将MCF-7细胞消化后铺在6 cm的培养皿中，过夜至细胞密度达70%左右。培养基后加入无血清MEM培养基，按照Lipofectamine 2000 Transfection试剂盒要求进行转染。孵育6～8 h后，弃去培养基，换成完全培养基后继续培养48 h。NC及PAIP1-siRNA的转染同miR-628-3p mimic的转染步骤。

1.2.4MTT法检测细胞相对存活率 收集对数期细胞，调整细胞密度为3 000个/孔，每孔100 μL加入96孔板，置37 ℃含有5% CO2培养箱培养。细胞经转染后，继续培养12、24、48、72 h，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，培养箱中继续孵育4 h，吸掉上清液，每孔加入100 μL DMSO后振荡10 min，用酶标仪在570 nm处测定吸光度(A)值。重复实验3次，以平均值统计结果，计算各浓度下细胞相对存活率。

1.2.5miRNA-628-3p靶基因预测和荧光素酶报告基因检测 通过TargetScan靶点预测软件预测context score值和context score percentile值，context score值越小和context score percentile值越大表示蛋白靶点概率越大。将miRNA-628-3p mimic、空载体阴性对照(NC)分别与PAIP1的3′-UTR野生型(pGL3-PAIP1 3′-UTR-WT)报告载体和突变型(pGL3-PAIP1 3′-UTR-MUT)报告载体共转入MCF-7细胞中，转染48 h后，吸取上清液，利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测萤火虫和海肾荧光素酶活性。

1.2.6Western blot检测PAIP1蛋白表达 提取转染后的各组细胞蛋白，Western blot检测PAIP1蛋白表达水平。细胞裂解液裂解并提取蛋白，BCA检测蛋白水平，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转印，5%脱脂奶粉封闭，封闭后加入相应一抗4 ℃摇床过夜，第2天加入相应二抗，室温孵育2 h 后TBST洗膜3次。ECL浸泡后用化学发光荧光成像系统对图像进行扫描和分析。

2 结 果

2.1miRNA-628-3p 在MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231细胞中的表达 RT-PCR 检测人正常乳腺上皮细胞MCF-10A与乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231中miR-628-3p的表达。与MCF-10A细胞组相比，乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231中miRNA-628-3p的表达水平显著降低(P<0.05)，见图1。此结果表明miRNA-628-3p在乳腺癌细胞中呈现低表达，本研究选取MCF-7细胞株进行后续实验。

2.2miR-628-3p在乳腺癌细胞MCF-7中的转染效率 RT-PCR检测miRNA-628-3p的转染情况，与NC组相比，转染miRNA-628-3p mimic的过表达组中miR-628-3p的表达水平显著增高(P<0.01)，见图2。

2.3过表达miR-628-3p抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖 通过MTT检测MCF-7细胞中过表达miR-628-3p之后细胞增殖的情况，绘制细胞生长曲线，空载体阴性对照组(NC)在48、72 h的相对细胞活力值为3.43±0.11、4.94±0.21，而miR-628-3p mimic组为2.32±0.19、2.93±0.20，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

a：P<0.05，与MCF-10A细胞组比较

图1RT-PCR检测各组细胞中miR-628-3p的表达

a：P<0.01，与NC比较

图2RT-PCR检测miR-628-3p和NC的转染效率

a：P<0.05，与NC比较

图3过表达miRNA-628-3p对MCF-7细胞增殖的影响

2.4miRNA-628-3p靶基因预测及验证 该miRNA的context score值为-0.40和context score percentile值为98，推测PAIP1是miR-628-3p潜在的靶基因。荧光素酶报告基因实验结果显示，野生型(Wild type，WT)PAIP1 3′ UTR质粒和miR-628-3p mimic共转染组，其荧光素酶活性显著低于野生型PAIP1 3′UTR质粒和空载体阴性对照(NC)共转染组(P<0.05)。而突变型(mutation，Mut)PAIP1 3′ UTR质粒和miR-628-3p mimic共转染组与突变型PAIP1 3′ UTR质粒和NC共转染组的荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)，结果显示PAIP1是miR-628-3p的靶点(图4A)。此外，Western blot结果显示，与NC组相比，miR-628-3p mimic组细胞中PAIP1蛋白水平显著降低(P<0.05，图4B)。

A：荧光素酶报告基因验证miR-628-3p靶基因PAIP1；B：Western blot检测上调miR-628-3p后PAIP1蛋白的表达水平。a：P<0.05，与NC比较

图4miR-628-3p的下游靶点的预测及验证

2.5抑制PAIP1的表达能够抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖 为了分析沉默PAIP1基因对MCF-7细胞增殖的影响，将si-NC及3条PAIP1-siRNA转染MCF-7细胞后，通过Western blot检测发现S1和S2两条siRNA较si-NC组可显著下调PAIP1蛋白表达(图5A)。另外通过MTT实验，发现用S1和S2两条siRNA抑制PAIP1的表达之后，48 、72 h时，S1和S2组细胞活力显著低于si-NC组(P<0.05，图5B)。

A：Western blot检测3条siRNA转染MCF-7细胞后PAIP1蛋白表达水平；B：抑制PAIP1表达之后MTT法检测细胞活力变化。a：P<0.05，与阴性对照Si-NC组相比

图5抑制PAIP1表达对MCF-7细胞增殖的影响

3 讨 论

研究发现，miRNA与恶性肿瘤的发生、发展有密切的关系，在肿瘤中有些miRNA呈现异常表达[12]。miRNA根据其在癌症发生中的作用分为两类：一类具有致癌作用，另一类具有抑癌作用。有些miRNA通过抑制抑癌基因的靶向mRNA，发挥致癌作用。例如miRNA-373-3p能够通过调控去甲肾上腺素促进结肠癌细胞的体外增殖[13]。另外，有些miRNA抑制癌基因的靶向mRNA表达，发挥抑癌作用。例如miRNA-126能够通过抑制核受体共激活因子7(nuclear receptor fibrosis,NCOA7)，影响芳香受体核转入因子(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT)的表达，进而抑制肺鳞癌细胞的增殖[14]。

近年来，miRNA-628-3p在许多癌症中异常表达，如结肠癌[15-16]、胃癌、胰腺癌[17]和肺癌。陈希媛等[11]研究发现miRNA-628-3p能有效抑制胃癌细胞HGC-27的增殖能力，并且促进细胞的凋亡；此外，PAN等[18]证实mir-628-3p通过负性调节热休克蛋白90(hot shock protein 90,HSP90)促进肺癌细胞A549凋亡和抑制迁移。然而，目前对于miRNA-628-3p在乳腺癌中的功能研究甚少。本研究结果首先提示，相对于乳腺正常上皮细胞，miRNA-628-3p在乳腺癌细胞中明显低表达，表明miRNA-628-3p可能参与乳腺癌的发生和发展过程。因此，本研究结果显示，转染miRNA-628-3p mimic的细胞增殖受到抑制，较阴性对照组有显著差异，这表明在乳腺癌发展过程中，miRNA-628-3p可通过抑制乳腺癌细胞的增殖从而发挥抑制癌基因的作用。

乳腺癌的发生和发展受到多种基因和蛋白的调控，这些相关基因和蛋白的研究对乳腺癌的发病机制的进一步研究具有重要的意义。PAIP1编码基因位于染色体5p12，由479个氨基酸组成[19]。PAIP1是一种翻译调节因子，一方面能与poly A结合蛋白(poly A binding protein,PABP)相互作用形成稳定的mRNA环形结构，另一方面还能与真核起始因子4A(eukaryotic initiation factor 4A,EIF4A)及EI相互作用形成三元复合体，进而调控蛋白质的翻译起始过程[20]。研究表明，翻译调控机制的异常，会导致蛋白质的合成发生异常，引起细胞增殖失调和恶性表型的转化，可诱导肿瘤[21]等疾病的发生。LI等[22]研究显示，敲除PAIP1抑制宫颈癌细胞生长，诱导细胞凋亡和细胞周期停滞，在体内肿瘤模型中，其过表达则促肿瘤作用。PIAO等[23]通过多变量分析表明PAIP1的高表达与组织学分级、生存率低有关。本研究通过生物信息学软件分析表明，PAIP1是miRNA-628-3p作用的靶基因，荧光素酶报告基因实验验证了该结果，并且在乳腺癌细胞MCF-7中过表达miRNA-628-3p后，PAIP1蛋白的表达水平显著降低，进一步说明PAIP1是miR-628-3p的直接靶点，miRNA-628-3p能够抑制乳腺癌细胞中的PAIP1蛋白水平。此外，MTT实验证明，抑制PAIP1基因的表达也跟过表达miRNA-628-3p的效果一样，抑制乳腺癌细胞的增殖。以上结果提示， miRNA-628-3p在乳腺癌细胞中低表达，可以通过负调控靶基因PAIP1抑制乳腺癌细胞的增殖。

综上所述，miRNA-628-3p可能是乳腺癌肿瘤发展过程中的重要因子，可能成为乳腺癌诊断或治疗的新靶点、预后的生物标志物，为乳腺癌的发病机制阐明提供新的思路。