亚洲人群中mircoRNAs与脑卒中发病关系的Meta分析*

杨锡彤，马 蓉，徐弘扬，王光明△

(1.大理大学第一附属医院基因检测中心,云南大理 671000;2.大理大学临床医学院,云南大理 671000)

脑卒中是一种突发性的脑血液循环障碍性疾病，全球每年大约有1 500万新发病的脑卒中患者；脑卒中后患者生活不能自理，致残率高达50%；因脑卒中而导致的病死率高达20%[1-2]。脑卒中是由多因素引起的复杂神经系统疾病，其中包括遗传因素及环境因素，而流行病学的研究认为脑卒中的发生与遗传因素有较大的关系[3]。

微小RNA(microRNA,miR)是一类内源性非编码小分子RNAs，在真核细胞中主要是由19～25个核苷酸组成，通过与基因信使RNA(mRNA)3′非编码端相结合，通过转录调控基因的表达，因此miR参与了包括细胞增殖、细胞发育、细胞分化、细胞凋亡和新陈代谢等一系列重要的生命进程[4-5]。单核苷酸基因多态性(SNP)是常见的遗传变异之一，主要存在于前体miR(pre-miR)，可影响成熟miR的表达。当前的研究表明，SNP的位点存在于4种前体miR，包括miR-146aC>G(rs2910164),miR-149T>C(rs2292832),miR-196a2T>C(rs11614913)和miR-499A>G (rs3746444)[6-7]。这4种miR能影响血管损伤反应,miR-146a，miR-149，miR-196a2和miR-499等位基因分别与肿瘤调节因子-α(TNF-α)、四氢叶酸还原酶、膜联蛋白1(ANXA1)、C反应蛋白(CRP)的调控有关[8-9],这些miRNA靶点与循环系统中的血栓或炎症通路有关[10]。本研究拟通过对已发表的miR-146aC>G、miR-149T>C、miR-196a2T>C和miR-499A>G基因多态性与脑卒中的相关性研究进行Meta分析，以得出较为客观的结论。

1 资料与方法

1.1检索策略 电子检索PubMed、Web of Science、CBM及知网、万方、维普中文数据库，检索时间从建库至2018年7月，获取有关miR基因多态性和脑卒中的文章。为提高文献的查全率和漏查率，分析过程中将进一步对入选研究的参考文献进行扩大检索，辅以文献追溯法查找相关文献，以提高Meta分析对文献查全率的要求。英文检索词包括miR、miR-146a、miR-149、miR-196a2和miR-499、polymorphism、SNP、stroke、ischemia、IS、cerebrovascular disease、brain hemorrhage、intracranial hemorrhage、cerebral hemorrhage、cerebral infarction,中文检索词包括miR-146a、miR-149、miR-196a2和miR-499、微小RNA、基因多态性、脑卒中、脑缺血、脑血管疾病、脑出血、脑梗死。

1.2文献纳入与排除标准 (1)纳入标准：①研究对象，评估miR-146a、miR-149、miR-196a2、miR-499基因多态性和脑卒中发病的相关性；②研究设计，文章为病例对照研究；③干预措施，病例组为脑卒中患者，对照组为健康人群；④足够充分的数据可用于计算OR值；⑤对照组基因型分布符合H-W遗传平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)。(2)排除标准： ①重复研究、发表的文献；②数据描述不清或样本资料交代不清，统计方法不恰当；③脑卒中诊断不明确或没有根据国际公认的标准；④综述文献；⑤非中、英文文献。

1.3质量评估 对纳入文献的质量评价采Newcastle-Ottawa量表(NOS)评价，通过入选人群、组间可比性、暴露因素测量3个方面共8个条目对文献质量进行评价，满分为9分，6分及以上认为是高质量文献[11-12]，评价项目包括(1)病例确定是否恰当，1分；(2)病例的代表性，1分；(3)对照组的选择，1分；(4)对照组的确定，1分；(5)实验设计和数据统计分析时考虑病例组和对照组的可比性，2分；(6)暴露因素的确定，1分； (7)病例组和对照组暴露因素的确定方法相同，1分；(8)无应答率，1分。

1.4数据提取 参考Cochrane协作网推荐的方法编制资料提取表,由2名研究者独立筛选文献、提取资料并进行交叉核对,如有不一致观点通过讨论进行解决。提取资料的主要内容为:(1)文献的基本特征 (包括文题、年份、研究者姓名等)；(2)所纳入文献研究对象的基本特征、干预措施和结局指标。研究特征：研究地区和人群特征、研究组和对照组的例数和年龄特征；数据提取：研究组和对照组的各基因型的分布情况。

1.5统计学处理 采用Review Manager5.3软件进行Meta分析，计数资料的效应指标选取比值比(OR)及其95%可信区间(CI)表示。异质性检验采用Q检验和I2统计量,如果异质性检验结果P≥0.05、I2<50%,表示各研究间无异质性,选用固定效应模型，计算合并比值并绘制森林图；如果异质性检验结果P<0.05、I2>50%,表示研究间存在异质性,选用随机效应模型。计算合并的OR和95%CI，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1纳入的文献基本特征 初步检索出文献146篇，按照文献纳入排除标准进行筛选，最终剩余11篇文献(图1)，文献对照组都符合HWE，共计8 493例研究对象，其中病例组4 179例，对照组4 314例，纳入研究的基本特征及对照组的HWE检测见表1～4。

图1 文献筛选流程图

表1 纳入研究的miR-146a rs2910164的基本特征

a为研究对象的年龄段

表2 纳入研究的miR-149 rs2292832的基本特征

表3 纳入研究的miR-196a2 rs11614913的基本特征

a为研究对象的年龄段

表4 纳入研究的miR-499 rs3746444的基本特征

2.2Meta分析的结果

2.2.1miR-146a rs2910164 对5种遗传学模型(Gvs. C、GGvs. CC、GCvs. CC、GG+GCvs. CC、GGvs. GC+CC)进行Meta分析，结果表明携带G或GG基因的人群并未增加脑卒中的发生风险(P>0.05)，见表5。

2.2.2miR-149 rs2292832 对5种遗传学模型(Cvs. T、CCvs. TT、CTvs. TT、CC+CTvs. TT、CCvs. CT+TT)进行Meta分析，结果表明miR-149 rs2292832基因多态性与脑卒中有相关性，人群中携带C或CC基因明显增加了脑卒中的发生风险，见表6。

2.2.3miR-196a2 rs11614913 对5种遗传学模型(Cvs. T,CCvs. TT,CTvs. TT,CC +CTvs. TT,CCvs. CT+TT)进行Meta分析，结果表明miR-196a2 rs11614913多态性与脑卒中的发生无相关性，见表7。

表5 miR-146a rs2910164 5种遗传学模型森林图结果统计

表6 miR-149 rs2292832 5种遗传学模型森林图结果统计

表7 miR-196a2 rs11614913 5种遗传学模型森林图结果统计

2.2.4miR-499 rs3746444 对5种遗传学模型(Gvs. A,GGvs. AA,GAvs. AA,GG+GAvs. AA,GGvs. GA+AA)进行Meta分析，结果表明miR-499 rs3746444多态性与脑卒中的发生无相关性，见表8。

表8 miR-499 rs3746444 5种遗传学模型森林图结果统计

3 讨 论

脑卒中的危险因素包括动脉粥样硬化、高血压、血脂异常和高同型半胱氨酸血症，这些都属于疾病因素，而目前多数临床研究表明遗传因素导致脑卒中发生的比例明显增加[24]。miR在许多生理和病理过程中，包括肿瘤发生、增殖、造血作用、代谢、免疫功能、表观遗传学和神经退行性病变疾病，发挥着重要作用[25]。近年新的研究表明，循环miR可能是心血管疾病的新生物标记物，包括急性心肌梗死、心力衰竭、冠状动脉疾病、糖尿病、脑卒中、原发性高血压和急性肺栓塞[26]。近年来有关miR基因多态性与脑卒中易感性的研究越来越多，但因为人群和地区存在差异导致同一种族最后的研究结果不尽相同。因此，本研究通过对miR基因多态性与亚洲人群脑卒中易感性进行Meta分析，揭示miR基因多态性与脑卒中之间的相关性，明确遗传因素对脑卒中诊断的意义。

4种miR多态性在前体miR中的序列，miR-146a C>G rs2910164位于5号染色体，159912418；miR-149 T>C rs2292832位于2号染色体，241395503；miR-196a2T>C rs11614913位于12号染色体，54385599；miR-499A>G rs3746444位于20号染色体，33578251[4-5]。这4种miR与血管损伤密切相关，miR-146、miR-149、miR-196a2和miR-499 分别调控TNF-α、四氢叶酸还原酶、ANXA1和CRP。TNF-α、四氢叶酸还原酶、ANXA1和CRP是导致脑卒中的一般原因。TNF-α与纤溶酶原激活物抑制剂1水平的升高有关，四氢叶酸还原酶功能障碍与血浆总同型半胱氨酸(tHcy)积累有关，ANXA1与TNF-α水平降低有关，CRP可以升高血压，而在压力条件下CRP和TNF-α能被同时激活[10]。这些研究表明，TNF-α、 ANXA1和 CRP之间有密切联系。事实上，尽管存在数据的限制性，但仍然有miR多态性功能的研究。miR-146a G和miR-196a2 T与成熟miR水平降低有关。miR-149T>C和miR-499A>G均未见成熟miR表达，然而miR-499A与血浆CRP水平降低有关，由此可知，作者怀疑miR-146a、miR-149、miR-196a2和miR-499 等位基因能够通过抑制TNF-α 和 CRP水平在脑卒中的发病机制中起到保护性作用[27]。

本研究结果表明，miR-146a、miR-149、miR-196a2及miR-499仅有miR-149 rs2292832基因多态性与脑卒中易感性相关，等位基因C和CC基因型明显增加脑卒中的患病风险。人群中携带CC基因型叶酸水平明显低于TT基因型[22]，miR-149通过与四氢叶酸还原酶的mRNA-3′UTR结合调控四氢叶酸还原酶基因的表达[27]。四氢叶酸还原酶在甲硫酸-叶酸的编码代谢中发挥着重要作用，人体内具有活性的miR-149-5p在四氢叶酸形成过程中起到促进作用[28]。miR-149 rs2292832位于miR-149前体非成熟结合区内，rs2292832能影响miR-149-5p表达，CC基因型人群中miR-149-5p的表达水平明显高于CT基因型和TT基因型[29]。有研究表明，体内的四氢叶酸还原酶表达的降低能增加脑卒中发病率，而脑卒中患者的叶酸水平明显比健康人群低，通过补充叶酸脑卒中的患病率得到明显改善[8，10]。因此可认为miR-149 rs2292832 C等位基因和CC基因型通过影响成熟miR-149，调控miR-149与四氢叶酸还原酶基因的结合，降低四氢叶酸还原酶基因表达，抑制甲硫酸-叶酸代谢，降低体内5-甲基四氢叶酸的生成，从而增加脑卒中的发生风险。

本研究纳入文献仅限于中英文符合要求的文献，研究人群为亚洲人群。亚洲人群miR基因多态性与脑卒中易感性相关性更合理、更可靠的结论依赖于开展大样本、多中心、同质性的病例对照研究。本次研究存在一定的局限性，希望扩大样本量和提高文献质量来完善本次研究，最终也需要扩大地区差异以进一步验证分析结果。

综上所述，在miR中，miR-149 rs2292832基因多态性与脑卒中的发生有相关性，临床医生应对遗传因素引起脑卒中的发生予以重视。