头穴丛刺干预对脑出血大鼠神经功能及脑组织含水量的影响∗

邵文娜 邵佳凯 沈诗彦 崔 海△

（1.首都医科大学，北京 100069；2.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010）

脑出血（ICH）是一种常见的脑卒中类型，其高致残性、高死亡率及高发病率的特点已得到医学界的广泛认可［1］。脑出血在中医学属于“中风病”中的“出血性中风”。现代医学对该病的治疗方法不多，且疗效并不理想，预后效果也不佳。近年来，关于针刺及电针治疗ICH的研究大幅增加，但对于头穴丛刺干预ICH的研究鲜有报道。本研究应用头穴丛刺激治疗ICH大鼠，并采用改良神经功能缺损严重程度评分及脑组织含水量的测定评价疗效，初步探讨其相应的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠72只，体质量200～300 g，由首都医科大学动物部提供［许可证号：SCXK（京）2016-0011］。分笼饲养于首都医科大学动物房内，温度（23±2）℃，相对湿度40%～70%，光照周期为12 h光照/12 h黑暗，自由获取食物和水。

1.2 试剂与仪器 1）试剂：胶原蛋白酶Ⅶ（C0773）（美国Sigma公司，1.5 KU，1000～3000 CDU/mg）；二甲亚砜（DMSO）（D5879）（美国Sigma公司，100 mL，98%）；选择性抑制剂锌原卟啉（ZPP-IX抑制剂）（Zn625-9）（美国Frontier公司，25 mg，96%）；75%酒精溶液（山东利尔康医疗科技股份有限公司，500 mL，75%）；0.9%氯化钠注射液（石家庄四药有限公司，500 mL，90%）。2）仪器：-20℃/4℃冰箱［中国青岛海尔股份有限公司，BCD-290W（专供）］；0.01 g天平（德国Sartorius公司，TE412-L）；脑立体定位仪（深圳RWD Life Science公司，C4F04-001）；电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司，101-0AB）；一次性无菌针灸针（云龙医疗器械公司，直径0.25 mm，长度25 mm）。

1.3 分组及造模 72只大鼠随机分为空白对照组、假手术组、模型组、头穴丛刺组、ZPP-IX抑制剂组、ZPP-IX抑制剂+头穴丛刺组，每组各12只，再分为1、3、7 d 3个亚组。采用Ⅶ胶原酶诱导制备大鼠脑出血模型［2-3］。在12 h禁食和4 h禁水后，用戊巴比妥钠（300 mg/kg）通过腹腔给药麻醉大鼠，待麻醉成功后将其备皮并固定在脑立体定位仪上，剪开头皮，暴露前囟、冠状缝和矢状缝。在右侧颅骨，于前囟后0.2 mm，右3 mm处，用钻头钻一个1 mm的小孔，在大鼠尾状核处用5 μL的微量注射器注入2 μL Ⅶ胶原酶（0.5 U/μL），深度5 mm，5 min内分次注射完毕后（0.2 μL/30 s），留针5 min，随后缓慢取出微量注射器，缝合伤口。待大鼠术后苏醒后根据Longa评分法［4］。0分：无神经缺陷；1分：未完全伸展左前爪；2分：向左旋转；3分：倒向左边；4分：没有自发行走，意识水平低下，进行神经功能评分，评分≥1分可认为模型制备成功［4］。模型制备失败及死亡的大鼠剔除实验，按照随机抽样原则选取大鼠重新造模。空白对照组不接受任何处理，假手术组造模钻孔后在尾状核处注入2 μL 0.9%氯化钠注射液，模型组造模钻孔后在大鼠尾状核注入2 μL胶原酶。

1.4 干预方式 头穴丛刺组进行头穴丛刺干预，取穴：根据《实验动物穴位图谱》［5］，取百会穴及百会左右两侧2 mm的四神聪穴，用一次性无菌针灸针进行针刺，留针30 min，每日1次，共7 d。ZPP-IX抑制剂组：造模术后30 min内腹腔注射ZPP-IX抑制剂（10 mg/mL）。ZPP-IX+头穴丛刺组：针刺同头穴丛刺组，ZPP-IX抑制剂用法用量同ZPP-IX抑制剂组。其余各组不进行针刺及药物干预。

1.5 标本采集与检测 每组随机选取3只于术后1、3、7 d过量麻醉后于冰面上断头处死，取脑组织称质量，各组1、3、7 d取脑组织后剩余的大鼠用于改良的神经功能缺损评分（mNSS）。用一次性无菌纱布稀释表面多余水分与血渍后，放于天平称质量，为湿质量；然后将脑组织放于60℃烘箱内烘48～96 h，反复称质量直至质量不再变化，为干质量。脑含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。

1.6 神经行为学评分 测试由对实验分组不知情的观察者进行。mNSS测试包括：运动、感觉、平衡和反射测试［6］。1）运动测试：提起大鼠尾部，前肢屈曲记1分，后肢屈曲记1分，30 s内在垂直轴头移动＞10°记1分；将大鼠放在地板上，正常行走0分，不能走直线记1分，向瘫痪侧转圈记2分，倒向瘫痪侧记3分。2）感觉测试：放置试验（视觉和触觉测试）1分，本体感觉试验（深感觉，按压大鼠爪子到桌子边缘刺激肢体肌肉）1分。3）平衡测试即平衡木试验：姿势稳定平衡0分，紧抓平衡木边缘记1分，紧抱平衡木且一肢体从其上面掉下记2分，紧抱平衡木且两肢体从其上面掉下或在其上面旋转（＞60 s）记3分，尝试在平衡木上保持平衡但摔下（＞40 s）记4分，尝试在平衡木上保持平衡但摔下（＞20 s）记5分，从不尝试平衡或抓住平衡木便落下（＜20 s）记6分。4）反射测试：耳郭反射（触及耳道时摇头）记1分，角膜反射（当用棉花触及角膜时眨眼）记1分，惊吓反射（对迅速敲击木板发出短暂声响的运动反应）记1分，癫痫发作，肌阵挛，肌张力障碍记1分［7］。mNSS神经功能缺损的程度从0～18评分（正常评分，0；最大评分，18）。标准设定如下：13～18分，严重伤害；7～12分，中度伤害；1～6分，轻伤；0分为正常，对伤害严重程度进行评分时，无法进行测试或缺乏测试反射可获得1分［8］。得分越高，损伤越严重。

1.7 统计学处理 应用SPSS23.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用方差分析进行正态分布检验及配对样本t检验进行组间差异比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 见表1。空白对照组与假手术组的各亚组均无明显的神经功能缺损，模型组、头穴丛刺组、ZPP-IX抑制剂组和ZPP-IX抑制剂+头穴丛刺组均在术后第1天评分开始升高，第3天评分达到最高值，第7天明显下降，头穴丛刺组在1、3、7 d的神经功能评分均低于头穴丛刺组（P＜0.05或P＜0.01），ZPP-IX抑制剂+头穴丛刺组在1、3、7 d的神经功能评分均低于ZPP-IX抑制剂组（P＜0.05或P＜0.01）。提示头穴丛刺可以降低脑出血大鼠神经功能评分，改善脑出血大鼠的神经功能。

表1 头穴丛刺干预对脑出血大鼠神经功能的影响（分，±s）

表1 头穴丛刺干预对脑出血大鼠神经功能的影响（分，±s）

与模型组同时间点比较，∗P＜0.05，∗P＜0.01；与ZPP-IX组同时间点比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

组别空白对照组假手术组模型组头穴丛刺组ZPP-IX抑制剂组ZPP-IX头穴丛刺组n 6 6 6 6 6 61 d 0.00±0.000.00±0.0012.00±2.909.50±2.26*12.50±2.959.00±1.26△3 d 0.00±0.000.00±0.0013.83±1.9411.83±2.23*14.00±1.6711.67±1.21△△7 d 0.00±0.000.00±0.004.00±0.632.67±0.82**4.33±0.522.83±0.75△△

2.2 各组大鼠脑含水量比较 见表2。空白对照组与假手术组的各亚组脑组织含水量无明显差异，模型组、头穴丛刺组、ZPP-IX抑制剂组和ZPP-IX抑制剂+头穴丛刺组均在术后第1天开始增加，第7天明显回降，与模型组比较，头穴丛刺组的脑含水量下降（P＜0.01），与ZPP-IX抑制剂组比较，ZPP-IX抑制剂+头穴丛刺组的脑含水量下降（P＜0.01）。提示头穴丛刺可以降低脑出血大鼠脑组织含水量，对脑水肿起到抑制作用。

表2 头穴丛刺干预对脑出血大鼠脑含水量的影响（%，±s）

表2 头穴丛刺干预对脑出血大鼠脑含水量的影响（%，±s）

组别空白对照组假手术组模型组头穴丛刺组ZPP-IX抑制剂组ZPP-IX头穴丛刺组n 3 3 3 3 3 31 d 75.96±0.90**75.36±0.10**79.08±0.1476.98±0.28**79.42±0.3377.00±0.52△△3 d 76.03±1.1676.22±1.1680.02±0.0676.08±0.04**80.52±0.21**76.38±0.03△△7 d 74.60±0.54**74.16±0.14**78.39±0.4374.90±0.43**78.30±0.44**75.67±0.43△△

3 讨论

脑出血是脑卒中的一种亚型，约占所有中风死亡的15%，约75%的幸存者患有严重的神经功能缺损［9-10］。在ICH后立即发生血肿周围的脑水肿，并在几天后出现峰值，如果不及时处理，严重者可破坏血脑屏障、减少脑血流量甚至引起脑萎缩［11-12］。针灸已被广泛用作中风患者的替代治疗方法，针灸有多种生物反应，包括循环和生化作用等，能在一定程度上缓解中风患者的痛苦［13］。头穴丛刺通过对前头部、后头部、侧头部腧穴的主治特点和作用规律的研究和总结，并借鉴超声波治疗原理提出了“针场”假说，在此基础上基于传统针灸疗法治疗中风病的不足和头部腧穴具有相互协同、综合调节的作用，结合临床实践和大脑解剖生理功能而提出［14-15］。头穴丛刺疗法治疗ICH效果显著，此治疗作用得到中医针灸界的公认［16］。有学者开展了头穴针刺治疗急性脑出血研究，表明脑出血急性期完全可以应用头穴针刺治疗而且疗效显著，应用头穴针刺干预ICH越早者疗效更加显著，其恢复时间越快，后期恢复水平也相对较高，尤其即刻效应和近期疗效的效果更加明显［17-18］。我们前期的临床研究发现头穴丛刺法操作简单、安全、疗效好，但其治疗机制至今未明。

本研究结果显示ICH后脑组织含水量及神经功能缺损评分在第3天达到最高值，而头穴丛刺组及ZPPIX抑制剂+头穴丛刺组有效降低了ICH大鼠的脑含水量及神经功能评分，因此在ICH早期进行头穴丛刺治疗，可有效降低ICH后的脑组织含水量，增加脑血流量，保护脑组织，使神经功能得以改善。除此之外，我们认为脑出血的作用机制可能与Nrf2通路下游的血红素氧合酶-1（HO-1）、醌氧化还原酶1（NQO1）有关，头穴丛刺在急性期进行干预可能是通过下调Nrf2、HO-1、NQO1的含量而降低脑损伤。ZPP-IX抑制剂可以抑制HO-1的表达，从而增加脑组织的损伤，笔者设立ZPP-IX抑制剂组与模型组比较，ZPP-IX抑制剂组的神经行为学评分增高，脑含水量升高，认为可能与Nrf2通路下游的HO-1的表达被抑制有关；ZPP-IX抑制剂组与ZPP-IX抑制剂+头穴丛刺组比较，ZPP-IX抑制剂+头穴丛刺组的神经行为学评分降低及脑含水量下降的程度更显著，说明头穴丛刺可以对脑损伤起到保护作用。

综上所述，头穴丛刺作为一种独特的针灸方式，可以在脑出血早期起到减少脑组织含水量、降低神经功能评分的作用，对脑组织起到保护作用，但具体的作用机制还有待我们下一步实验研究发现。