柚皮苷联合头穴针刺对脑缺血大鼠血管新生及Notch1/Akt/eNOS通路的影响

陈 悦，王珍珍，王文生·王月，李 喆

(1. 乌鲁木齐市中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000；2. 海军军医大学海军特色医学中心，上海 200052)

缺血性脑卒中是一类具有高病死率、高致残率的常见脑血管疾病，主要由颈椎动脉狭窄闭塞，局部血流量减少所致，以脑组织缺血坏死所引起的神经功能症状为主要表现[1]。脑组织缺氧缺血发生后，如能尽早恢复局部血供，重建微血管循环，则可明显减轻缺血区组织梗死，加快神经功能的修复[2]。有研究表明，脑组织缺血后，Notch1/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路可参与调节内皮细胞的增殖、侵袭，并通过上调血管内皮生长因子(VEGF)及其受体的表达介导微血管代偿性再生，是调节脑缺血疾病微血管新生的重要靶点[3-4]。柚皮苷可改善脑缺血再灌注损伤，且在骨折愈合过程中可有效促进血管生成，但其对脑缺血损伤的保护作用是否与促血管新生相关尚未明确[5-6]。头穴针刺在脑血管疾病的康复治疗中应用广泛，在脑缺血大鼠模型中，可诱导缺血区内皮细胞增殖和微血管新生[7-8]。本实验通过柚皮苷灌胃和针刺经验效穴“百会”“风府”疗法干预局灶性脑缺血大鼠，评价二者单独和联合应用对大鼠神经损伤的保护效果，并通过Notch1/Akt/eNOS 信号通路探讨其发挥作用的可能机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级SD雄性大鼠120只，体重180～220 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物合格证号： SCXK(新)2020-0024。实验开始前于温度(23±3)℃、相对湿度40%～70%、明暗12 h交替的SPF级动物房中适应性喂养，自由进食饮水，定期更换垫料。本研究方法和目的符合实验动物福利和伦理学要求，所有内容均经乌鲁木齐市中医医院伦理委员会审批通过(2021L013)。

1.2实验药物与试剂 柚皮苷购自Sigma公司，用生理盐水稀释至所需浓度；尼莫地平购自山东新华制药股份有限公司(20 mg/片)；华佗牌一次性无菌毫针购自苏州医疗用品厂有限公司(0.22 mm×25 mm)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；大鼠VEGF、血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2) ELISA试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司；VEGF一抗、羊抗大鼠IgG-生物素、DAB试剂盒购自武汉博士德公司；Notch1、Akt、磷酸化Akt (p-Akt)、eNOS、磷酸化eNOS(p-eNOS)、GAPDH鼠单克隆抗体购自Santa Crutz公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自TaKaRa公司，基因上下游引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成提供。

1.3实验方法 将SD大鼠按体重随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组、柚皮苷组、头穴针刺组、柚皮苷+头穴针刺组，每组20只。除假手术组外，其余组大鼠均采用血管内栓线阻断法制备局灶性脑缺血模型[9]：大鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，局部皮肤消毒，随后于颈部正中切开1 cm，分离并暴露右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，用缝合线结扎颈总动脉近心端，同时用微动脉夹夹闭颈内动脉，在距离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉分叉约5 mm处用显微剪剪开一小口，将栓线由颈总动脉插入颈内动脉，再经颈内动脉进入大脑中动脉以阻断其血流，随后结扎颈总动脉和颈内动脉远心端，逐层缝合切口并碘伏消毒，假手术组仅分离上述血管而不插栓线。造模后参考Longa等[10]标准对大鼠进行神经功能障碍评分，评分为1～4分即为模型制备，将造模成功大鼠纳入实验，剔除未成功及意外死亡大鼠，并按实验条件随机补充大鼠。造模成功后，尼莫地平组给予尼莫地平混悬液12 mg/kg灌胃；柚皮苷组给予柚皮苷溶液80 mg/kg灌胃；头穴针刺组给予头穴针刺干预，参照《大鼠穴位图谱》定位百会、风府穴后，使用毫针针刺，连接电针仪(连续波，频率150 Hz)，每次留针15 min；柚皮苷+头穴针刺组给予柚皮苷溶液80 mg/kg灌胃和头穴针刺干预(操作同头穴针刺组)；假手术组及模型组给予等量生理盐水灌胃。各组均每天干预1次，连续干预7 d。

1.4观察指标及方法

1.4.1神经功能障碍评分 干预结束后，参考Longa等[10]标准对各组大鼠神经功能障碍进行评分并比较。评分标准：神经行为未见异常为0分；提起鼠尾，缺血侧前肢不能完全伸展、内旋为1分；行走时向手术对侧转圈，不能直行为2分；行走时向手术对侧倾斜，行走有困难为3分；意识出现障碍，不能自发行走为4分。

1.4.2脑组织含水量 神经功能障碍评分结束后腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，腹腔取血后，各组随机选取5只大鼠断头处死，取脑组织。采用预冷生理盐水清洗脑组织，定性滤纸吸干水分后精密称重，即得脑组织湿重；随后将脑组织置于60 ℃ 的恒温箱中放置72 h，烘干后取出，反复称重，至2次重量差<0.3 mg时即为脑组织干重。随后根据公式计算脑组织含水量：脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.4.3脑梗死体积 腹腔取血后，各组随机选取5只大鼠断头处死，取脑组织，采用TTC染色测定脑梗死体积：预冷生理盐水冲洗脑组织，定性滤纸上吸干水分后置于-20 ℃冰箱内冷冻 20 min，将脑组织沿冠状面每隔2 mm切片，切成均匀的5片，置于2% TTC染液于37 ℃ 温箱中避光孵育30 min，经PBS冲洗3次后，4%多聚甲醛中固定24 h后，将大脑切片取出观察拍照，正常脑组织为红色，梗死区域为白色或未染色，用Image Pro软件分析并计算脑梗死体积：脑梗死体积=脑梗死面积/脑切片面积×100%。

1.4.4血清中VEGF、VEGFR-2水平 神经功能障碍评分结束后，各组大鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，经腹主动脉采血，3 000 r/min下离心15 min，将所得血清分装冻存备用，根据ELISA试剂盒操作步骤检测血清中VEGF、VEGFR-2水平。

1.4.5海马组织中VEGF阳性表达情况 腹腔取血后，各组随机选取5只大鼠，开胸暴露心脏并剪开左心室，将灌注针从左心室插入至升主动脉固定，随后灌注4 %多聚甲醛PBS溶液150 mL，1 h后取脑组织，置于4 %多聚甲醛溶液中，4 ℃下固定72 h，将脑组织沿冠状面切成2 mm厚的脑片，取含海马的脑片进行石蜡包埋，切片，将切片脱蜡、透明、脱水后，0.3%的H2O2室温下封闭20 min，蒸馏水洗后行抗原热修复，5%BSA封闭20 min，一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育20 min，SABC 37 ℃孵育20 min，DAB显色，蒸馏水冲洗后封片，于光学显微镜下观察VEGF阳性表达情况并拍照(阳性呈棕黄色至棕褐色，主要定位于细胞膜和细胞质)，采用Image J软件计算3个视野的VEGF阳性细胞数。

1.4.6海马组织中Notch1/Akt/eNOS通路相关蛋白表达情况 腹腔取血后，各组随机选取5只大鼠处死，取海马组织，置于RIPA裂解液中提取组织总蛋白，采用BCA试剂盒于562 nm波长测定总蛋白浓度，制胶后上样10 μL蛋白样品，经凝胶电泳分离，PVDF转膜后，加入5%脱脂牛奶封闭2 h，滴加一抗溶液4 ℃过夜，TBST洗膜，加入二抗室温孵育2 h，TBST洗膜，滴加ECL发光液显色，凝胶成像仪曝光拍摄，采用Image J软件测定各条带灰度值，以GAPDH为内参，计算Notch1蛋白相对表达量及p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS。

1.4.7海马组织中Notch1/Akt/eNOS通路相关因子mRNA表达情况 取大鼠海马组织，采用Trizol一步法提取海马组织总RNA，紫外分光光度法检测总RNA 浓度，取总RNA 2 μg反转录得到cDNA，以cDNA为模板，按照RT-PCR试剂盒操作步骤检测Notch1、p-Akt、p-eNOS mRNA表达情况。反应条件：95 ℃变性5 s，退火温度 60 ℃ 34 s，扩增40个循环，结果以GAPDH为内参，用2ΔΔCt法计算Notch1、p-Akt、p-eNOS mRNA相对表达量。各基因引物序列：Notch1上游5’- CAGCCACCATCACAGCCACA-3’，下游5’-ATGCCCTCGGACCAATCAGA -3’；p-Akt上游5’-CTCACTGTGGCTGTGGTCACCTA-3’，下游5’- GGGTCTTCGGGCTTCAGGTTA-3’；p-eNOS上游5’-GCATACCCGCACTTCTGT-3’，下游5’- GCCTTGGCATCTTCTCCC -3’；GAPDH上游5’-TACCCACGGCAAGTTCAACG -3’，下游5’-CACCAGCATCACCCCATTTG-3’。

2 结 果

2.1各组大鼠神经功能评分比较 假手术组大鼠未见神经功能缺陷，模型组、尼莫地平组、柚皮苷组、头穴针刺组和柚皮苷+头穴针刺组大鼠神经功能评分分别为(2.27±0.79)分、(1.44±0.45)分、(1.60±0.56)分、(1.67±0.51)分、(1.49±0.43)分，尼莫地平组、柚皮苷组、头穴针刺组和柚皮苷+头穴针刺组评分均明显低于模型组(P均<0.05)，且柚皮苷+头穴针刺组和尼莫地平组均明显低于柚皮苷组、头穴针刺组(P均<0.05)，柚皮苷+头穴针刺组和尼莫地平组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2各组大鼠脑组织含水量及脑梗死体积比较 模型组大鼠脑组织含水量明显高于假手术组(P<0.05)，存在明显脑梗死；尼莫地平组、柚皮苷组、头穴针刺组和柚皮苷+头穴针刺组大鼠脑组织含水量和脑梗死体积均明显低于模型组(P均<0.05)，且柚皮苷+头穴针刺组和尼莫地平组均明显低于柚皮苷组、头穴针刺组(P均<0.05)，柚皮苷+头穴针刺组和尼莫地平组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

2.3各组大鼠血清中VEGF、VEGFR-2水平比较模型组大鼠血清中VEGF、VEGFR-2水平均明显高于假手术组(P均<0.05)；尼莫地平组、柚皮苷组、头穴针刺组及柚皮苷+头穴针刺组大鼠血清中VEGF、VEGFR-2水平均明显高于模型组(P均<0.05)，且柚皮苷+头穴针刺组和尼莫地平组均明显高于柚皮苷组、头穴针刺组(P均<0.05)，柚皮苷+头穴针刺组和尼莫地平组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 假手术组和脑缺血各组大鼠血清中VEGF、VEGFR-2水平比较

2.4各组大鼠海马组织中VEGF阳性表达情况比较 假手术组海马组织CA1区可见少量VEGF阳性细胞；模型组VEGF阳性染色细胞数明显多于假手术组(P<0.05)；尼莫地平组、柚皮苷组、头穴针刺组及柚皮苷+头穴针刺组VEGF阳性染色细胞数均明显多于模型组(P均<0.05)，且柚皮苷+头穴针刺组和尼莫地平组均明显多于柚皮苷组、头穴针刺组(P均<0.05)，柚皮苷+头穴针刺组和尼莫地平组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1及图 2。

图1 假手术组和脑缺血各组大鼠海马组织中VEGF阳性表达情况(IHC，×200)

A为假手术组；B为模型组；C为尼莫地平组；D为柚皮苷组；E为头穴针刺组；F为柚皮苷+头穴针刺组

2.5各组大鼠海马组织中Notch1/Akt/eNOS通路蛋白表达情况比较 与假手术组比较，模型组大鼠海马组织中Notch1蛋白相对表达量明显增高，p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS比值明显降低(P均<0.05)；尼莫地平组、柚皮苷组、头穴针刺组及柚皮苷+头穴针刺组大鼠海马组织中Notch1蛋白相对表达量及p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS比值均明显高于模型组(P均<0.05)，且柚皮苷+头穴针刺组和尼莫地平组均明显高于柚皮苷组、头穴针刺组(P均<0.05)，柚皮苷+头穴针刺组和尼莫地平组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3。

A为假手术组；B为模型组；C为尼莫地平组；D为柚皮苷组；E为头穴针刺组；F为柚皮苷+头穴针刺组

2.6各组大鼠海马组织中Notch1/Akt/eNOS通路mRNA表达比较 与假手术组比较，模型组大鼠海马组织中Notch1 mRNA相对表达量明显增高(P<0.05)，p-Akt和p-eNOS mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05)；尼莫地平组、柚皮苷组、头穴针刺组及柚皮苷+头穴针刺组大鼠海马组织中Notch1、p-Akt 、p-eNOS mRNA相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，且柚皮苷+头穴针刺组和尼莫地平组均明显高于柚皮苷组、头穴针刺组(P均<0.05)，柚皮苷+头穴针刺组和尼莫地平组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 假手术组和脑缺血各组大鼠海马组织中Notch1/Akt/eNOS通路相关因子mRNA相对表达量比较

3 讨 论

缺血区新生微血管的形成能够增加局部微循环血量，改善血液循环，是缺血性脑损伤神经功能恢复的关键[11]。在缺血性脑卒中发病初期，缺血区神经细胞发生可逆性变性，如能有效促进缺血区新生血管形成，及时恢复局部血流量，可为受损神经细胞功能的修复提供良好的微环境，进而减轻缺血区脑组织损伤程度，促进患者神经功能的恢复[12]。

柚皮苷是从芸香科植物柚的果皮和果实中所提取的一种黄酮类化合物，能够在心血管疾病中发挥抗炎、抗氧化应激作用[13]。在脑缺血再灌注损伤大鼠模型中，柚皮苷具有抗氧化、加速自由基清除作用，可显著减轻大鼠脑组织水肿，缩小梗死体积[5]。Song等[6]研究显示，在去势大鼠骨折愈合过程中，柚皮苷可通过调节VEGF和VEGFR-2的表达刺激血管生成，促进大鼠骨痂处血管生长。而柚皮苷是否可通过促进微血管生成发挥脑保护作用尚不明确。

头针作为一种行之有效的中医治疗手段，在脑血管疾病的康复治疗中得到了广泛应用，并证实可加快脑卒中患者脑功能的康复[14]。李虹霖等[15]研究发现，对头部穴位的刺激可通过生物电效应刺激大脑皮质，使变性受损的神经细胞觉醒，以促进神经细胞功能的修复。樊云等[16]研究发现，头穴针刺还可促进局灶性脑缺血大鼠缺血区内皮细胞增殖，刺激脑内微血管新生。百会、风府均为督脉之要穴，是治疗脑缺血性疾病常用穴位，正如《行针指要歌》原文中所记载“或针风，先向风府百会中”。督脉为人体诸阳之总汇，百会为督脉、手足三阳经及足厥阴经之会，居于头顶中央最高位，统领一身之阳；风府为督脉与阳维脉之会；联合针刺二穴，可起到开窍醒神、疏经通络、振奋阳气之功。

本实验通过线栓法复制局灶性脑缺血模型，评价柚皮苷、头穴针刺单独和联合应用对大鼠受损脑组织和神经功能的修复效果，结果显示柚皮苷和头穴针刺单独或联合应用均能有效降低大鼠神经功能评分，减轻脑组织水肿，缩小梗死体积，其中柚皮苷与头穴针刺联合应用效果更为显著。

目前研究发现，内皮细胞特异性的VEGF与其功能受体VEGFR-2结合后，可通过诱导内皮细胞增殖，促使毛细血管瓣生成，对脑组织缺氧缺血后血管新生起到正性调控作用[17]。在脑缺血血管新生过程中，VEGF和Notch相互调控，VEGF在缺氧缺血环境下能够诱导Notch受体Notch 1活化，而阻断VEGF后，可见Notch的表达明显减少[18]。Akt 是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，在多种细胞增殖、迁移、凋亡等过程中发挥关键作用，其活化与内皮细胞增殖和分化关系密切[19]。多项研究表明，Akt 和Notch1信号之间存在相互作用，Notch1/Akt通路可参与调节内皮细胞的增殖和侵袭[20-21]。激活的Akt 可进一步促使其下游效应分子eNOS磷酸化，后者可通过上调VEGF等血管内皮生长因子的表达发挥促血管新生作用[22]。本实验结果显示，模型组血清VEGF和VEGFR-2水平及海马组织中VEGF阳性表达数、Notch1蛋白及mRNA相对表达量均明显高于假手术组，p-Akt/ Akt和p-eNOS/ eNOS比值均明显低于假手术组；尼莫地平组、柚皮苷组、头穴针刺组和柚皮苷+头穴针刺组大鼠血清VEGF和VEGFR-2水平，海马组织中VEGF阳性表达数、p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS比值、Notch1蛋白及Notch1、p-Akt、p-eNOS mRNA相对表达量均明显高于模型组，且柚皮苷+头穴针刺组和尼莫地平组均明显高于柚皮苷组、头穴针刺组。表明柚皮苷和头穴针刺能够通过促进Notch1/Akt/eNOS信号转导途径的激活发挥促血管新生作用。

综上所述，柚皮苷和头穴针刺治疗可通过促进脑缺血大鼠Notch1/Akt/eNOS信号通路的活化，促进缺血区新生血管形成，从而改善缺血区组织周围血流灌注，进而减轻大鼠脑组织损伤，促进神经功能恢复，且二者在发挥各自作用的同时相辅相成，协同增效。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。