健脾防哮方抑制哮喘小鼠气道上皮间质转化的研究

劳慧敏，陈梦琦，刘宣妤，李丽博，尹训君

(1. 山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011；2. 山东大学临床医学院，山东 济南 250011；3. 山东中医药大学，山东 济南 250014；4. 山东博奥克生物科技有限公司，山东 聊城 252000)

支气管哮喘简称哮喘，是一种儿童时期常见的呼吸道疾病，其特征是不可逆的气流阻塞、气道炎症和气道高反应性[1]。近年来，儿童哮喘的发病率逐年攀升，从2010年的3.02%上升至4%左右，严重危害儿童身心健康[2-3]。气道炎症和气道重塑是哮喘的两个主要病理特征[4]，其中气道重塑是哮喘难以根治的重要原因[5]。研究表明，气道重塑与上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)有密切联系[6]，EMT是气道重塑的重要标志[7-8]。目前，皮质类固醇是控制哮喘发作的最有效药物[9]，但是部分患者存在耐药[10]，且治疗时间长、依从性差，导致哮喘反复发作，迁延难愈。近年来，中医药治疗哮喘凸显优势。本课题组通过多年工作积累，根据儿童哮喘慢性持续期病理特点，提出“脾虚-痰瘀互结”为哮喘的主要病机，凝练出具有益气健脾、化痰通络功效的健脾防哮方，前期研究已证实该方可有效减轻哮喘缓解期患儿气道阻塞，恢复小气道功能，改善哮喘小鼠气道重塑。本实验从上皮间质转化标志蛋白表达入手，探讨了健脾防哮方减轻哮喘EMT的效应机制，以为哮喘防治提供新思路和有效的实验依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 8周龄SPF级雄性Balb/c小鼠，体重20～25 g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，合格证号：SCXK(鲁)2019-0003，由山东中医药大学附属医院动物实验中心饲养。环境温度为(22±2)℃，湿度为40%～60%，实验动物自由饮水摄食，12 h明暗交替。本实验经山东中医药大学附属医院动物实验中心实验伦理委员会审查批准(AWE-2019-050)，符合动物伦理学要求。

1.2药物及试剂 健脾防哮方由黄芪15 g、清半夏15 g、陈皮15 g、茯苓9 g、当归9 g、乌梅6 g组成，中药饮片均购自山东中医药大学附属医院，由山东中医药大学附属医院制剂室代煎浓缩成1.05 g/mL，置4 ℃冰箱中冷藏备用。卵清蛋白(美国Sigma公司，批号：A5378)；地塞米松(美国Sigma公司，批号：D4902)；苏木素染液套装(武汉谷歌生物科技有限公司，货号：G1005)；Masson三色染色液(武汉谷歌生物科技有限公司，货号：G1006)；E-钙黏素(E-cadherin)抗体(PTG，货号：20874-1-AP)；alpha smooth muscle Actin Rabbit mAb(博奥森，货号：bsm-33187M)；N-钙黏素(N-cadherin) Rabbit pAb(ABclonal，货号：A19083)；RNA isolater Total RNA Extraction Reagent(Vazyme，货号：R401-01)；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(Vazyme，货号：R223-01)；ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，货号：R311-02)；BCA Protein Assay Kit(Cwbio，货号：CW00145)；E-cadherin(24E10)Rabbit mAb(CST，货号：#3199)；N-cadherin(D4R1H)XP®Rabbit mAb(CST，货号：#13116)；a-Smooth Muscle Actin (D4K9N)XP®(CST，货号：#19245)。

1.3仪器 压缩机雾化器(欧姆龙，型号：NE-C900)；正置光学显微镜(日本尼康，型号：A19083)；医用离心机(湘仪，型号：TGL-16M)；多功能酶标仪(synergy)；0.45um PVDF膜(Milipore，货号：IPVH00010)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016)；脱水机、包埋机(武汉俊杰电子有限公司，型号分别为JJ-12J，JB-P5)；组化笔(Gene tech，型号：GT1001)；荧光定量PCR仪(Bio-Rad，型号：CFX96 Touch)；电泳仪(BIO-RAD，型号：PowerPac Basic)；凝胶成像系统(CE，型号：AI600BGB)。

1.4实验方法 小鼠于山东中医药大学附属医院实验中心动物室内适应性饲养1周后，按照随机数字法分为正常组、模型组、健脾防哮方低剂量组、健脾防哮方中剂量组、健脾防哮方高剂量组和地塞米松组，每组10只，以耳标进行数字标记。除正常组外，其余组小鼠参照Flanagan等[11]造模方法并加以改进制备哮喘模型：第1，7，14天腹腔注射0.1 mL致敏液(生理盐水0.1 mL+卵蛋白0.05 mg+氢氧化铝1 mg)；从第22天开始，将致敏小鼠放置于自制动物雾化箱内，使用1%的卵蛋白雾化液(卵蛋白0.1 g+生理盐水10 mL)加压雾化激发30 min，隔日1次，共4周。各药物组于第22天开始加压雾化激发前灌胃给药，药物剂量根据小鼠与人给药剂量比值9.1∶1，按照成人60 kg体重等倍剂量换算。正常组及模型组给予25 mL/(kg·d)蒸馏水灌胃, 健脾防哮方低、中、高剂量组分别给予5.233 g/(kg·d)、10.465 g/(kg·d)、20.93 g/(kg·d)健脾防哮方灌胃，地塞米松组给予地塞米松0.5 mg/(kg·d)灌胃，均持续4周。

1.5检测指标和方法 末次干预结束后，各组小鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，仰卧固定小鼠，取出肺脏，右肺PBS缓冲液迅速冲洗后，立即置于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋、组织切片后，进行HE、Masson染色和免疫组化检测；左肺迅速置于液氮罐，后转移至-80 ℃冰箱存放，进行Real-time PCR检测和Western blot检测。

1.5.1肺组织病理形态学观察 将4%多聚甲醛固定的肺脏组织进行梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制片，在病理切片机上5 μm连续切片，进行HE和Masson染色，110倍观察全视野，并置于200倍、400倍光学显微镜下观察肺组织及气管病理变化。

1.5.2肺组织中E-cadherin、N-cadherin和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达免疫组化检测 石蜡切片经脱蜡复水，组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(pH 6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。切片放入3%过氧化氢溶液孵育25 min，阻断内源性过氧化物酶；血清封闭加一抗(E-cadherin，1∶500；N-cadherin，1∶1 000；α-SMA，1∶1 000)，孵育过夜，PBS洗涤后，加HRP-Goat&Rab IgG(1∶200)，室温孵育50 min。经3次5 min洗涤，滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。经Harris苏木素复染细胞核，酒精、二甲苯Ⅰ脱水，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。

1.5.3肺组织中E-cadherin、N-cadherin、α-SMA表达Western blot检测 取-80 ℃冻存的肺组织30 mg，加入RIPA缓冲液和PMSF快速匀浆，冰上裂解20 min， 4 ℃下12 000 r/min离心15 min，吸取总蛋白，定量后根据BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书测定蛋白浓度。在10%丙烯酰胺凝胶上用SDS-PAGE电泳分离，电转至0.45 μm PVDF 膜上；用5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，分别加入E-cadherin一抗(1∶3 000)、N-cadherin一抗(1∶2 000)、α-SMA一抗(1∶200)、β-actin内参(1∶5 000)，于 4 ℃孵育过夜。TBST洗涤5次，每次5 min，在室温下分别加入山羊抗兔IgG二抗与山羊抗小鼠IgG二抗(均1∶5 000)孵育1 h后，ECL显影法曝光显色并进行灰度值测定，结果以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示。

1.5.4肺组织中E-cadherin、N-cadherin、α-SMA mRNA表达Real-time PCR检测 用RNA分离总RNA提取试剂，采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix进行cDNA反转录，后进行Real-time PCR反应，将GAPDH作为内参。反应体系包括2×Master Mix 10 μL，10 μmol/L的PCR特异引物F 0.50 μL，10 μmol/L的PCR特异引物R 0.50 μL，加水至总体积为18 μL，将18 μL混合液加到PCR板对应的每个孔中，再加入对应的2 μL的cDNA。反应条件：95 ℃，30 s；40个PCR循环 (95 ℃，5 s；60 ℃，40 s)。建立PCR产物的熔解曲线分析，每个样品重复3次。数据采用2-ΔΔCt法进行分析。引物设计见表1。

表1 实时定量PCR引物序列

2 结 果

2.1各组小鼠肺组织形态 正常组小鼠支气管结构清晰完整，黏膜上皮细胞完整且排列整齐，无炎性细胞浸润和聚集；与正常组相比，模型组小鼠支气管上皮细胞不完整，存在坏死，且炎性细胞浸润明显；各药物组小鼠支气管结构出现不同程度的修复，上皮细胞损伤程度及炎症细胞浸润程度有所减轻，其中健脾防哮方高、中剂量组和地塞米松组改善更为明显。见图1。

图1 正常组和哮喘各组小鼠肺组织HE染色病理形态

2.2各组小鼠支气管上皮下胶原沉积与肌纤维增生情况 正常组小鼠气道上皮下及气道周围未见明显胶原纤维沉积；模型组小鼠气道周围存在明显胶原纤维沉积；各药物组小鼠胶原蛋白沉积明显减少，其中健脾防哮方高、中剂量组和地塞米松组胶原沉积减少更明显。见图2。

图2 正常组和哮喘各组小鼠支气管上皮下胶原沉积与肌纤维增生情况(Masson染色)

2.3各组小鼠肺组织免疫组化检测E-cadherin、N-cadherin、α-SMA表达情况 与正常组比较，模型组小鼠N-cadherin、α-SMA表达增加(P均<0.05)， E-cadherin表达减少(P<0.05)。与模型组比较，各药物组N-cadherin、α-SMA表达明显减少(P均<0.05)，E-cadherin表达明显增加(P均<0.05)，且健脾防哮方高、中剂量组和地塞米松组各指标表达变化较健脾防哮方低剂量组更明显(P均<0.05)。见图3～5及表2。

表2 正常组和哮喘各组小鼠肺组织免疫组化检测E-cadherin、N-cadherin、α-SMA表达情况比较

图3 正常组和哮喘各组小鼠肺组织E-cadherin表达情况(免疫组化，×200)

2.4各组小鼠肺组织Western blot检测E-cadherin、N-cadherin、α-SMA表达情况 与正常组比较，模型组小鼠肺组织中N-cadherin和α-SMA相对表达量均明显升高(P均<0.05)，E-cadherin相对表达量明显降低(P<0.05)。与模型组比较，各药物组小鼠肺组织中N-cadherin和α-SMA相对表达量均明显降低(P均<0.05)，地塞米松组和健脾防哮方高、中剂量组小鼠肺组织中E-cadherin相对表达量均明显升高(P均<0.05)，且健脾防哮方高、中剂量组和地塞米松组各指标表达变化较健脾防哮方低剂量组更明显(P均<0.05)。见图6及表3。

表3 正常组和哮喘各组小鼠肺组织Western blot检测E-cadherin、N-cadherin、α-SMA表达情况

图4 正常组和哮喘各组小鼠肺组织N-cadherin表达情况(免疫组化，×200)

图5 正常组和哮喘各组小鼠肺组织α-SMA表达情况(免疫组化，×200)

A为正常组；B为模型组；C为健脾防哮方低剂量组；D为健脾防哮方中剂量组；E为健脾防哮方高剂量组；F为地塞米松组

2.5各组小鼠肺组织中α-SMA、E-cadherin、N-cadherin mRNA表达情况 与正常组比较，模型组小鼠肺组织中N-cadherin和α-SMA mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05)，E-cadherin mRNA相对表达量明显降低(P<0.05)。与模型组比较，各药物组小鼠肺组织中N-cadherin和α-SMA mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05)，地塞米松组和健脾防哮方高、中剂量组小鼠肺组织中E-cadherin mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05)，且健脾防哮方高、中剂量组和地塞米松组各指标表达变化较健脾防哮方低剂量组更明显(P均<0.05)。见表4。

表4 正常组和哮喘各组小鼠肺组织E-cadherin、N-cadherin、α-SMA mRNA表达情况

3 讨 论

目前研究表明， EMT是上皮细胞丧失表型特征，并获得间质细胞样表型的复杂生物学过程，其特点为N-cadherin、α-SMA增多， E-cadherin减少[12-14]。有研究表明，EMT能导致哮喘气道上皮的纤维化并促进平滑肌增生，破坏上皮屏障，加重气道炎症，是目前支气管哮喘发病机制的研究热点和难点[15-16]。因此，延缓EMT的发展可能成为哮喘治疗的潜在靶点。

本课题组一直致力于中医药防治哮喘的研究，传承中医药治疗哮喘特色经验，结合儿童哮喘病机特点，首次提出“脾虚为本，痰瘀为标”是哮喘的基本病机，治疗以益气健脾、化痰通络为治则。健脾防哮方由黄芪当归药对与二陈汤化裁而来，方中炙黄芪健运脾气，助运化，益气固表，为君药。清半夏味辛平，可入上焦肺，又可入中焦脾胃；在脾，燥湿之力显著，祛脾湿，助脾运；在肺，降肺气，化痰涎；与黄芪配伍，辛散化中焦而补肺气。陈皮理气健脾、燥湿化痰，防止黄芪滋腻碍脾，涩滞气机，补中寓运，以健运脾气，使肺气恢复。茯苓既为健脾良药，又可渗湿，与半夏、陈皮相合，有燥湿化痰、理气和中之效。《神农本草经》记载当归主咳逆上气，本方用当归治咳喘，兼顾活血化瘀通络。乌梅一药多用，一则乌梅酸涩，可敛肺定喘；二可防止半夏辛温燥烈伤及肺气，为使药。全方配伍，切中病机。

本实验HE和Masson染色发现，健脾防哮方可以减少卵蛋白诱导的小鼠上皮细胞脱落坏死，缓解支气管周围炎症细胞浸润及胶原纤维沉积，表明健脾防哮方可抑制哮喘小鼠气道炎症及气道重塑。肺组织E-cadherin、N-cadherin、α-SMA检测发现，与正常组比较，模型组小鼠肺组织中N-cadherin、α-SMA表达增加，E-cadherin表达减少，表明哮喘发病过程中有EMT参与，与既往报道一致；健脾防哮方高、中剂量组 N-cadherin、α-SMA表达减少，E-cadherin表达增加，表明健脾防哮方可调控EMT。

综上所述，哮喘病理过程中有EMT参与，健脾防哮方可能是通过调控EMT而起到减轻哮喘小鼠气道炎症及气道重塑作用的。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。