5型腺病毒E1A基因通过调控GP73的表达抑制肝癌细胞增殖的初步研究

李栋宇，魏从文，宫静，钟辉，汪浩勇

1. 湖北工业大学，湖北 武汉430068；2. 军事医学研究院 生物工程研究所，北京100850；3. 安徽大学，安徽 合肥230000

人5 型腺病毒（adenovirus type 5，Ad5）早期区域1A（early region 1A，E1A）基因是近年新发现的一种抑癌基因，其通过2 个外显子的可变剪接来编码2 种主要蛋白质，而这2 种早期病毒蛋白（长度为243～289 个氨基酸残基）可以激活或抑制几种病毒或细胞基因的转录，从而调节细胞周期到达抑癌作用[1-2]。Ad5E1A 还具有转化和反式激活活性。通过直接竞争RB1 蛋白上的相同结合位点，诱导从RB1 中分离出E2F1 转录因子，E2F1 的释放导致ARF 蛋白介导的MDM2 被抑制并导致TP53/p53 积累，因为它不再是MDM2 介导的泛素化降解的目标。反过来，TP53 的增加将阻止细胞增殖并介导其死亡[3]。虽然Ad5E1A 已被确定是一种有效的转录激活因子，但人们对其如何改变细胞转录知之甚少[4]。原发性肝癌（肝癌）恶性程度高，预后极差，手术、化疗的疗效均不佳，近年来基因治疗和细胞治疗已成为有效的新型疗法。现有研究表明，Ad5 对肝癌细胞有较强的生长抑制作用[5]，但是其抑制机制尚不明确。

高尔基蛋白73（Golgi protein 73，GP73）是一种跨膜糖蛋白，2000 年由Kladney 等[6]发现。研究发现，GP73 可作为肝癌诊断的标志物[7-8]。GP73在正常肝组织中几乎不表达，但在各种原因引发的肝脏疾病中，几乎所有肝细胞均有表达，特别是结缔组织周边和肝硬化结节部位表达尤其强烈[9]。70%以上的肝癌病人，GP73 蛋白在血清及肝组织中的表达水平均显著上调[10]。多篇文章报道GP73 在肝癌组织和血清中呈高表达，张宏冰等发现mTORC1 能够通过调节GP73 促进肝癌的发生发展[11]。已有研究证实了GP73 在肝癌发生发展及转移中的重要作用。我们前期研究发现，GP73 对肿瘤微环境具有重要的调节作用。之前研究未报道Ad5E1A 与GP73 的相互作用，因此探讨Ad5E1A 基因对GP73 的表达具有重要的科学意义。本研究中，我们在肝癌细胞HepG2 中过表达Ad5E1A 基因，并观察其对GP73 表达水平的影响以及肝癌细胞的增殖情况，为下一步研究肝癌发生机制，开发新型治疗方案提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚胎肾细胞HEK293T、肝癌细胞HepG2（本实验室保存）；pcDNA3-Flag-GP73（本实验室构建）；腺病毒（李山虎教授赠与）；大肠杆菌DH5α（北京擎科生物科技有限公司）；限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ，T4DNA 连接酶（TaKaRa 公司）；胶回收试剂盒（Promega 公司）；质粒提取试剂盒（天根公司）；DMEM 培养基（Gibco 生物公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；anti-Myc 抗体、anti-Flag 抗体、anti-Tubulin 抗体（Sigma-Aldrich 公司）；脂质转染试剂jetPRIME（Polyplus 公司）；100 mmol/L 青霉素（华北制药集团）；100 mmol/L 链霉素（山东鲁抗集团）；引物合成和测序由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2 Ad5E1A基因真核表达载体pcDNA3-Flag-Ad5E1A（Flag-Ad5E1A）的构建

以腺病毒为模板进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收PCR 产物。PCR 产物和pcDNA3-Flag-Vetor 质粒分别经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，酶切产物于室温下连接后转化感受态大肠杆菌DH5α，在氨苄青霉素筛选压力下于LB 培养板37℃培养过夜,挑取单克隆在LB 培养基中扩增，进行菌液PCR 鉴定及测序。通过NCBI Blast进行序列比对，序列正确的质粒命名为pcDNA3-Flag-Ad5E1A。

1.3 细胞培养、转染及免疫印迹分析

细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM 中，转染前24 h 细胞接种于培养皿中。转染前1 h 更换一半新鲜的DMEM 培养基，按说明书要求配制质粒和转染试剂混合液，滴加入细胞，常规培养，4～6 h 后补充另一半培养基。转染后24 h 收集细胞，1×PBS 冲洗3 次，3000 r/min 离心3 min 后弃上清。加人适量NP-40 裂解液［10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1%NP40］，冰上裂解细胞15 min，12 000 r/min 冷冻离心后取上清，加入4×SDS 缓冲液［10%甘油，2%十二 烷基 磺 酸钠，50 mmol/L Tris-Cl（pH6.8），2.5% β-巯基乙醇，0.1%溴酚蓝］，沸水浴10 min，12 000 r/min 离心10 min，取上清进行SDSPAGE，半干法转到PVDF 膜上，用5%脱脂牛奶液室温封闭1 h，一抗和二抗分别室温孵育1 h，TBST 洗3 次，每次5 min，将Perkin Elmer 的ECL发光液均匀涂在PVDF 膜上，暗室显影。

2 结果

2.1 pcDNA3-Flag-Ad5E1A真核表达载体的构建

按1.2 所述方法，首先对目的基因Ad5E1A 进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果见图1A，在750～1000 bp 处出现特异扩增条带，与目的片段Ad5E1A（870 bp）相符。构建pcDNA3-Flag-Ad5E1A 真核表达载体，随机挑选平板上的3 个单克隆菌落，分别编号为1、2、3，在含氨苄青霉素的LB 培养基中扩增后进行菌液PCR 鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果见图1B，5-1、5-3 泳道750～1000 bp处出现特异性扩增条带，与目的片段Ad5E1A 相符。选取5-1、5-3 号对应的菌液测序，结果正确，命名为pcDNA3-Flag-Ad5E1A。

2.2 Flag-Ad5E1A在HEK293T细胞中的表达

将Flag-Ad5E1A 质粒转染HEK293T 细胞，通过免疫印迹检测重组质粒的表达，结果如图2，构建的真核表达质粒在HEK293T 细胞中均得到表达，产物相对分子质量约33×103，与预期相符。

2.3 Ad5E1A基因过表达后对HepG2细胞中GP73表达的影响

图1 琼脂糖凝胶电泳检测Ad5E1A 基因扩增产物（A），菌液PCR 鉴定插入目的基因片段（B）

实验组为过表达GP73 的HepG2 细胞中转染Ad5E1A 基 因，对 照组为 过表达GP73 的HepG2 细胞中转染Flag-Vector，各组均在37℃、5% CO2条件下培养，24 h 后收集细胞，用含10% β-巯基乙醇的SDS 裂解液裂解细胞，进行免疫印迹实验。结果见图3，与对照组相比，实验组的GP73 表达水平明显降低。

2.4 pcDNA3-Flag-Ad5E1A抑制GP73表达进而影响HepG2细胞增殖

将HepG2 细胞均分为4 组，用酶标仪测定D450nm值，分析细胞增殖情况。与转染Flag-GP73组相比，Ad5E1A 组的抑制率为17.5%，差异无统计学意义（P＞0.05）；而与转染Flag-GP73 组比，共转Ad5E1A 和GP73 组的抑制率为37.8%，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4）。因此可以看出，Ad5E1A 基因的抑制HepG2 细胞增殖作用与GP73相关。抑制率（%）=（对照组D450nm值-实验组D450nm值）/对照组D450nm值。

图2 HEK293T 细胞中Flag-Ad5E1A 蛋白的表达

图3 Ad5E1A 基因过表达对HepG2 细胞中GP73 表达的影响

图4 单独转染GP73 和共转GP73、Ad5E1A 时HepG2 细胞的增殖情况

3 讨论

肝癌作为发病率和病死率极高的癌症之一，一直都是科研人员以及临床工作者努力攻克的难题[12]。GP73 是维持动物正常生存以及肝肾生长发育的重要因子。近年来的研究发现GP73 有可能成为更好的诊断肝癌尤其是早期肝癌的血清标志物，因此GP73 的生理和病理作用受到广泛关注[13]。之前研究表明GP73 诊断临床肝癌的敏感性和特异性分别高达77%和93%，说明GP73可以作为早期肝癌诊断的标志物。早前我们实验室研究发现GP73 和CD206 的高表达与肝癌预后不良有关，现有研究也已经提供了关联GP73和致癌作用机制的一些见解，包括基质金属蛋白酶13（MMP13）的激活。此外，GP73 对肝癌的生长和转移具有免疫依赖性。GP73 可通过下调IL-12A 的表达使抗肿瘤淋巴细胞Th1 作用减弱。人Ad5E1A 基因作为腺病毒的极早期基因，具有抑癌基因的特性，携带E1A 基因而E1B 和E3 基因缺陷的腺病毒可靶向性在肿瘤细胞内增殖, 扩大杀伤肿瘤效果，同时又不会使原代细胞转化[14]。Ad5E1A 基因影响转录水平的表达，可以观察到当转入所构建的Ad5E1A 基因时，HepG2 细胞中GP73 的表达水平显著减低。进一步，我们发现与单独过表达GP73 相比，共同过表达Ad5E1A 和GP73 时肝癌细胞增殖水平被抑制。之前报道GP73 的表达水平与肝癌有密不可分的关系，然而两者之间的机制尚不明确。近年来靶向治疗成为热点，因此构建人Ad5E1A 基因表达载体，研究其与GP73 之间的关联，对于靶向治疗肝癌有重要的参考价值，可为临床治疗提供科学依据。