辽宁碱蓬SlNAC4转录因子的基因克隆及原核表达

柳 凯，宿明星，王宏飞，李秋莉

(辽宁师范大学生命科学学院 辽宁省植物生物技术重点实验室 辽宁 大连116081)

转录因子可以与基因的启动子结合，从而调控下游基因的表达，对基因的表达调控具有重要作用。NAC转录因子是植物特有的一类转录因子，是最大的转录因子家族之一，其命名来源于矮牵牛(PetuniahybridaVilm)的NAM及拟南芥(Arabidopsisthaliana(L.) Heynh)的ATAF1/2和CUC2是由Souer等第一个发现[1]。NAC转录因子在植物生长发育以及抵抗生物和非生物胁迫的过程中发挥着至关重要的作用[2]。

辽宁碱蓬(SuaedaliaotungensisKitag.)属于黎科碱蓬属，是一种典型的盐生植物，其体内存在着耐盐适应的复杂机制，是研究植物耐盐碱机理的良好材料[3]。本实验室先前已经成功克隆得到了辽宁碱蓬SlNAC1、SlNAC2、SlNAC8基因，并将其转到拟南芥中，发现其增强了转基因拟南芥抵抗非生物胁迫的能力[4-6]。本研究将根据辽宁碱蓬转录组数据库中的EST序列，获得辽宁碱蓬SlNAC4转录因子基因，并对SlNAC4进行原核表达。为进一步研究辽宁碱蓬SlNAC4转录因子功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 植物材料

辽宁碱蓬(SuaedaliaotungensisK.)采自辽宁省大连市营城子盐场。

1.1.2 质粒和菌株

克隆载体pEASY-T1 Simple Vector购自TransGen Biotech，表达载体pGEX-4T-1为实验室保存；大肠杆菌DH5a感受态和Rosetta菌株购自北京全式金生物有限公司。

1.1.3 实验试剂

DNA Marker DL 2000、DNA Marker DL 5000、3′-Full RACE Core Set Ver.2.0限制性内切酶、T4-DNA Ligation Enzyme、RNase等购自TaKaRa，2×EasyTaq Super Mix、卡那霉素购自TransGen Biotech。

1.2 仪器与设备

低温高速离心机(美国Thermo公司)；PCR仪,(美国Bio-Rad公司)；琼脂糖凝胶电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；无菌超净工作台(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)

1.3 实验方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成

称取100 mg辽宁碱蓬叶片，采用TRIZOL法提取碱蓬叶片总RNA，琼脂糖凝胶电泳、分光光度法检测RNA的完整性及纯度。以总RNA为模板,使用PrimeScript© RT Master Mix Perfect Real Time(Takara)试剂盒，反转录形成cDNA第一条链。

1.2.2SlNAC4基因EST序列验证

根据辽宁碱蓬转录组测序获得的SlNAC4的EST序列，利用Primer Premier 5软件设计特异性引物 4-EST-F、4-EST-R(表1)。以获得的cDNA为模板进行PCR扩增，回收PCR产物，并送至宝生物公司测序。

1.2.3SlNAC4基因3′RACE 扩增

将测序结果与已知SlNAC4 EST序列进行比对，获得SlNAC4 EST准确序列，经与其他NAC序列比对，发现SlNAC4基因的3′端缺失。根据已确认的EST序列设计物NAC4-3-Outer、NAC4-3-Inner(表1)，以cDNA为模板，采用3′-Full RACE Core Set Ver. 2.0试剂盒(Takara)进行3′端的扩增。将最终的Inner PCR反应产物回收，送至宝生物公司测序，将获得的序列与EST序列拼接。

1.2.4SlNAC4基因的克隆

以拼接好的序列为模板，设计引物NAC4-全长-F、NAC4-全长-R(表1)。以cDNA为模板进行PCR扩增，产物回收后测序，获得SlNAC4 cDNA序列。将SlNAC4克隆至pEASY-T1载体。

1.2.5SlNAC4基因的生物信息学分析

利用NCBI数据库在线软件Blast，对辽宁碱蓬SlNAC4序列进行相似性和同源性分析；用Conserved domain finder程序分析辽宁碱蓬SlNAC4保守结构域；利用ORF Finder软件分析其开放阅读框；BioEdit软件进行多重序列比对，用MEGA 4.0软件构建NJ进化树。

1.2.6 原核表达SlNAC4蛋白

将SlNAC4基因与表达载体pGEX-4T-1用BamHI和EcoRI同时进行双酶切，再用DNA连接酶连接，构建pGEX-NAC4重组表达载体。将pGEX-NAC4重组表达载体导入大肠杆菌Rosetta中，37℃、160 r/min、IPTG浓度分别为0.1mM、0.25 mM、0.5 mM、0.75 mM、1 mM条件下诱导表达SlNAC4蛋白。

表1 PCR反应引物，由上海生工生物有限公司合成Table 1 PCR reaction primer, synthesized by Shanghai bioindustrial biology Co.Ltd

2 实验结果

2.1 辽宁碱蓬叶片总RNA提取

利用琼脂糖凝胶电泳检测提取的辽宁碱蓬RNA(图1)，其中28SrRNA、18SrRNA条带整齐无明显拖尾，且带型边缘比较清楚，表明提取RNA没有降解。分光光度法测定OD260/OD280值为2.0，表明提取的RNA纯度较高。

2.2 SlNAC4基因EST序列验证

以RNA为模板，反转录获得cDNA，对已知的SlNAC4 EST序列进行验证(图2)，获得了850 bp左右的片段，将测序结果与原序列比对，获得了准确的SlNAC4 EST序列。

图1辽宁碱蓬叶片总RNA电泳图M: DL2000 DNA Marker; 1，2: 辽宁碱蓬叶片总RNAFig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA of leaf S. liaotungensis M: DL2000 DNA Marker; 1, 2: The total RNA of S. liaotungensis

图2 SlNAC4 EST片段电泳图 M: DL2000 DNA Marker; 1:SlNAC4 EST片段Fig.2 The EST sequence of SlNAC4 verification electropherogram M: DL2000 DNA Marker;1: The fragment of SlNAC4 EST

2.3 SlNAC4基因 3′RACE

在确定SlNAC4 EST序列基础上进行3′RACE，得到了1700 bp左右的Outer PCR产物和1500 bp左右的Inner PCR产物,经回收测序，得到了SlNAC4基因3′端序列，3′端序列有poly(A)结构。

图3 SlNAC4 3’RACE琼脂糖凝胶电泳图Fig.3 SlNAC4 3'RACE agarose gel electrophoresis M: DL2000 DNA Marker; 1:SlNAC4 3' RACE outer PCR; 2:SlNAC4 3' RACE inner PCR

2.4 SlNAC4基因的克隆

将SlNAC4 EST、3′端序列拼接，得到了SlNAC4基因的cDNA序列。经PCR测序，获得了SlNAC4基因(图4)。

2.5 SlNAC4基因的生物信息学分析

SlNAC4基因全长1450 bp(GenBank登录号:KJ933531)，其中开放阅读框为996 bp，编码331个氨基酸(图5)。具有保守的NAM结构域(图6)，NJ进化树分析结果表明SlNAC4与刚毛柽柳(TamarixhispidaWilld)ThNAC1亲源关系较近(图7)。

2.6 原核表达SlNAC4蛋白

在37℃、160 rpm/min、不同IPTG的浓度下，诱导重组蛋白表达。结果在预测的蛋白分子量大小(63 KD)处有一条较粗的条带，且与空载对比明显(图8)，因此认为重组NAC4-GST融合蛋白成功表达。

图4 SlNAC4 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图 M；Maker DL2000; 1：SlNAC4 cDNAPCR产物Fig.4 Agarose gel electrophoresis of SlNAC4 PCR product M: Maker DL2000; 1: The product of SlNAC4 cDNA PCR

图5 SlNAC4开放阅读框编码的氨基Fig. 5 Amino acid sequence encoded by the SlNAC4 open reading frame

图6 SlNAC4的预测保守结构Fig.6 The predicted conservative structure of SlNAC4

图7 SlNAC4进化树Fig.7 SlNAC4 evolution tree

图8 37℃不同IPTG浓度诱导的蛋白表达Fig.8 Protein expression induced by different IPTG concentrations M：Protein Marker(10 kDa-180 kDa)；1：SlNAC4未诱导2：SlNAC4 0.1mM IPTG诱导；3：SlNAC4 0.25mM IPTG诱导4：SlNAC4 0.5mM IPTG诱导；5：SlNAC4 0.75mM IPTG诱导；6：SlNAC4 1mM IPTG诱导；7：pGEX空载未诱导; 8：pGEX空载0.5mM IPTG诱导；

3 讨论

植物NAC转录因子在植物生长发育及抵抗外界生物和非生物的胁迫中发挥着十分重要的作用[7-9]。目前已从很多物种中克隆出NAC基因。王立国等克隆出了陆地棉(GossypiumhirsutumLinn.)GhSNAC1基因，并发现过表达GhSNAC1可显著提高转基因烟草的抗旱耐盐能力[10]。方义生等从大豆(GlycinemaxMerr.)中克隆了GmNAC8基因，过表达GmNAC8基因提高了转基因拟南芥的耐旱能力[11]。He等从南荻(TriarrhenalutarioripariaL.)中克隆了MlNAC10 基因，发现其可以提高转基因拟南芥的耐旱性和耐盐性[12]。NAC转录因子结构特点为，其N端具有一个高度保守NAM结构域[13,14]。本研究克隆了辽宁碱蓬SlNAC4基因。生物信息学分析发现，其N端具有保守的NAM结构域，且与刚毛柽柳ThNAC1的相似度较高。认为获得了辽宁碱蓬NAC转录因子家族的一个新成员-SlNAC4基因。凝胶迁移实验是在体外验证转录因子与启动子相互作用的常用方法[15]。本研究利用大肠杆菌原核表达了SlNAC4蛋白，经SDS-PAGE电泳检验，结果在目的片段大小处得到了一条较粗的条带，且与空载对照明显，说明已成功获得了SlNAC4蛋白。这将为进一步分析辽宁碱蓬SlNAC4转录因子的下游调控基因打下了基础。辽宁碱蓬SlNAC4基因的获得对分析NAC转录因子的功能、理解辽宁碱蓬的耐盐机制具有十分重要的意义。这将为进一步分析辽宁碱蓬SlNAC4转录因子的下游调控基因打下了基础。辽宁碱蓬SlNAC4基因的获得对分析NAC转录因子的功能、理解辽宁碱蓬的耐盐机制具有十分重要的意义。