乌龙茶多酚对高脂饮食诱导肥胖小鼠模型肠道菌群的调节作用

郭彤彤，宋 丹，张 鑫

(宁波大学食品与药学学院，浙江 宁波 315800)

近年来，超重和肥胖逐渐成为人们关注的焦点，并已成为全球经济和健康的负担[1]。据世界卫生组织统计，2016年世界上近40%的成年人超重，约有13%的人肥胖，该比例在过去40年中增加了两倍。肥胖是能量破坏的结果，也是许多慢性疾病的重要危险因素，包括非酒精性脂肪性肝病，II型糖尿病和心血管疾病[2]。因此，肥胖的预防和治疗已成为重要的公共卫生问题，减肥药的开发亦势在必行。

人体肠道中的微生物多达1014种微生物，比人类细胞总数高10倍，已知的细菌种类至少1000种[3]。这种复杂的微生物生态系统在人类健康中发挥着重要作用[4]。研究表明，接受肥胖人类粪便微生物的无菌小鼠比接受正常体重人类粪便微生物的小鼠的体重显著增加[5]。肠道微生物菌群与肥胖之间的关系引起了学者的广泛关注。

饮食对肠道微生物的组成，多样性和丰富度有显著影响[6]。改变肠道微生物群或补充特定益生元或益生菌可减轻肥胖或糖尿病啮齿动物模型中的肥胖和代谢功能障碍[7]。茶在世界各地广泛消费，其推定的活性成分归因于多酚。乌龙茶多酚(Oolong tea polyphenols, OTP)可以为有益微生物提供有利生长条件，并改变肠道微生物群的结构，发挥类似的益生元功能[8]。OTP中的主要酚类化合物是儿茶素，包括表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate, EGCG)，表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin gallate, ECG)，表没食子儿茶素(Epigallocatechin, EGC)和表儿茶素(Epicatechin, EC)，它们是茶中最重要的生物活性物质[9]。作为一种独特的甲基化形式的EGCG，表没食子儿茶素3-O-(3-O-甲基)没食子酸酯(Epigallocatechin 3-O-(3-O-methyl)gallate, EGCG3”Me)已显示出有效的抗肥胖活性[10]。此外，EGCG3”Me有益于肠道菌群系统的稳定性，特别是在高脂肪饮食(High fat diet, HFD)诱导的肥胖小鼠模型中引发的微生物失衡[11]。然而，关于OTP与肠道微生物群之间相互作用的研究鲜见报道。在本研究采用高脂日粮饲养建立高脂肥胖小鼠模型，应用16S rDNA测序技术，探究OTP对HFD小鼠肠道菌群的影响，以期为OTP的深入研究及减肥产品的研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验试剂、仪器与动物

1.1.1 试验试剂

乌龙茶多酚(纯度98%)，实验室自制；TC、TG、HDL-C和LDL-C试剂盒，南京建成生物工程研究所；油红O染色试剂，美国Sigma公司；氯化钠、异丙醇、无水乙醇、多聚甲醛购于国药集团有限公司；DNA提取试剂盒(D4015-02)，美国Omega Bio-tek公司；DL 2000 DNA Maker(3427A)，日本宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖(RA1011-Agarose LE-100G)，上海捷瑞生物工程有限公司。

1.1.2 试验仪器

AY-120型电子精密天平(日本Shimadzu公司)；无菌硬质粪便收集袋(上海申安医疗器械厂)；BioTekSYNERGY H1四光栅全功能酶标仪(美国BioTek仪器有限公司)；5418R小型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；5804R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；Leica CM1950冷冻切片机(德国Leica公司)；Leica CM2245组织切片机(德国Leica公司)；MX-S/MX-F型旋涡混合器(大龙兴创实验仪器北京有限公司)；NanoDrop ND-2000型核酸定量仪(美国Thermo公司)。

1.1.3 试验动物

6周龄、雄性C57BL/6J小鼠(体重为20±2 g)，购于上海斯莱克实验动物有限公司。饲养于宁波大学试验动物中心，试验动物许可证号：SYXK(浙江)2013-0191，温度控制在22±2℃，湿度控制在55%±5%，自由摄食和饮水，单笼饲养，12 h光照和12 h黑暗交替。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组

适应1周后，将小鼠随机分为3组，低脂饮食组(LFD组)，高脂饮食组(HFD组)，高脂饮食-乌龙茶多酚组(HFD-OTP组，0.1% OTP)，每组8只小鼠。他们的体重，食物和水摄入量每周记录两次，并且每周计算他们的平均值。在0周(OTP-0)，2周(OTP-2)，4周(OTP-4)和8周(OTP-8)对HFD-OTP组收集粪便样品用于16S rDNA测序分析。所有给药连续进行8周，然后在戊巴比妥麻醉下进行剖腹手术。分离肝脏和附睾脂肪并立即称重，并立即将所有样品快速冷冻并储存在-80℃直至使用。

1.2.2 血清生化指标检测

小鼠血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C含量均采用南京建成生物工程研究所生产的测试盒进行检测，测定方法严格按试剂盒说明进行测定。

1.2.3 肝脏组织病理学检测

将经过4%多聚甲醛溶液固定24 h后的肝脏组织，进行常规石蜡包埋，进行油红O染色，光学显微镜下观察肝脏脂肪变性程度。

1.2.4 粪便细菌DNA提取与16S rDNA测序分析

参考文献中报道的方法加以改进用于提取粪便中细菌的总DNA[12]。采用E.Z.N.A.©Stool DNA Kit (D4015-02，Omega，美国)，按照说明书进行。采用NanoDrop system检测DNA浓度与纯度。

参照文献[13]，取用10 ng的DNA模板，依16S rDNA V3-V4区序列，用带Barcode的特异引物(引物序列为314F5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’和805R 5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)进行PCR扩增。根据PCR产物浓度进行等量混样，使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用胶回收试剂盒回收产物。用TruSeq©DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，将构建好的文库经Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，运用HiSeq2500 PE250进行上机测序。

将各组的样品数据从下机数据中拆分出来，截去Barcode与引物序列之后，采用FLASH对双端序列进行拼接，过滤成高质量Tags数据。进行Tags截取与长度过滤，处理去除嵌合体序列，得到最终的有效数据。使用Verseach(Version 2.3.4)软件过滤嵌合序列，将具有97%一致性序列聚类成为操作单元(OTUs)。基于样品OUT结果，使用QIIME软件(Version 1.8.0)，计算用于分析样品物种多样性和丰度的指数包括Chao1，Shannon和Simpson。同时选取OTUs代表性序列，用Mothur方法与SILVA的SSUrRNA数据库对其进行物种注释且获得分类学信息，在门(phylum)与属(genus)分类水平上，统计样本的群落结构组成并进行分析。

1.2.5 数据处理与分析

数据结果用平均值±标准误表示，利用SPSS 17.0统计软件，计量资料进行Duncan’s多重比较检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 OTP处理可减轻体重，降低脂肪量，减少肝脏脂肪变性

在第8周试验结束时，比较各组小鼠平均体重，结果如图1，发现HFD组和HFD-OTP组小鼠体重与LFD组相比均具有显著性差异(P<0.05)；HFD-OTP组平均体重显著小于HFD组(P<0.05)，这表明OTP显著缓解了肥胖小鼠的体重增加。

鉴于在8周饮食干预期结束时HFD-OTP组的体重增加比HFD组低4.0 g，我们随后检查了不同实验组中脂肪和肝脏组织的变化。在这里，我们发现经OTP处理后，有效减少了HFD诱导的肥胖小鼠的脂肪量(P<0.01，图2A)。同时，HFD-OTP组肝脏重量略有下降，与HFD组相比无显著差异(图2B)。然而，OTP处理后油红O染色区域的百分比显著下降，表明OTP可以降低HFD诱导的肝脏脂肪积累，降低肝脏病变的风险(图2C)。

图1 补充OTP期间各组小鼠体重变化Fig.1 The changes in body weight of mice in each group during OTP supplementation注：LFD组与HFD组比较，#P < 0.05差异显著，##P<0.01差异极显著；HFD-OTP组与HFD组比较，*P < 0.05差异显著，**P < 0.01差异极显著；图2同。

2.2 OTP处理对小鼠血清生化指标的影响

研究表明肥胖等疾病有着高水平的总胆固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)和低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)[14]。从表1可以看出，与LFD组相比，HFD组小鼠血清TC、TG、LDL-C明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。与HFD组相比，HFD-OTP组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平明显降低，高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。由此可见，OTP能在一定程度上调节高脂饮食小鼠体内血脂水平，长期饮用乌龙茶对身体有益。

2.3 OTP处理对饮食诱导肥胖小鼠肠道微生物多样性的影响

为了构建由HFD诱导的肥胖引起的肠道菌群改变和OTP处理对肠道微生物群的影响，我们通过16S rDNA测序方法，得到了粪便菌群多样性和菌群丰度。如表2，Chao1指数和Shannon指数随着OTP处理时间的延长而提高，Simpson指数则随着OTP处理时间的延长而显著降低。该结果表明，肥胖小鼠肠道细菌群落的多样性对着OTP处理时间的延长而增加并且在第8周时达到最大值(P< 0.05)。这说明OTP增加了HFD诱导的肥胖小鼠肠道内微生物菌群的多样性。

图2 OTP处理对小鼠脂肪量和肝脏脂肪变性的影响Fig.2 Effect of OTP treatment on fat mass and hepatic steatosis in mice注：A：小鼠脂肪组织重量；B：小鼠肝脏组织重量；C：小鼠肝脏组织油红O染色图片(400倍)。

表1 小鼠血清生化指标的变化Table 1 The changes of biochemical parameters of mice.

注：同行中不同字母表示数值间差异性达到显著水平(P<0.05)；表2同。

表2 OTP对HFD诱导的肥胖小鼠模型的生物多样性的影响Table 2 The influence of OTP on the biodiversity of the HFD-induced obesity mouse model

为了进一步表明OTP对肠道菌群组成的影响，我们在门(phylum)和属(genus)水平上比较了不同时间处理下小鼠粪便肠道菌群的结构组成(图3)。研究表明，在门分类水平上，HFD诱导的小鼠中优势菌群包括拟杆菌门(Bacteroidetes)，厚壁菌门(Firmicutes)，放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)。在4个实验组中，Actinobacteria和Proteobacteria的相对丰度变化不大，而OTP处理中Bacteroidetes的相对丰度随着处理时间的增加而显著增加(P< 0.05)，与此同时，Firmicutes的相对丰度降低(P< 0.05)。这表明菌群Bacteroidetes及Firmicutes对OTP的摄入敏感。此外，F/B从0.80±0.02(OTP-0)降至0.41±0.01(OTP-8)。

热图( heatmap) 是以颜色的变化反映各种细菌在样本中的相对丰度变化。本实验中，我们利用热图对相对丰度较大的前20个细菌OTU在属的水平进行比较(图4)，结果表明，在属的分类水平上，拟杆菌属(Bacteroides)，另枝菌属(Alistipes)，双歧杆菌属(Bifidbacterium)，乳酸杆菌属(Lactobacillus)，劳特氏菌属(Blautia)，瘤胃球菌属(Ruminococcus)，Barnesiella和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)等菌群的相对丰度在OTP喂养8周后显著增加(P< 0.05)。其中，菌群Bacteroides和普雷沃氏菌属(Prevotella)在每个采样时间点上均为菌群。同时，菌群Prevotella，Odoribacter，考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)和梭菌属XlVa (ClostridiumXlVa)的相对丰度随着OTP处理时间的延长显著降低(P<0.05)。

图3 HFD-OTP组小鼠肠道菌群在门水平的相对丰度Fig.3 Relative abundance of gut microbiota in mouse at the revel of phylum

图4 HFD-OTP组小鼠肠道菌群在属水平的相对丰度Fig.4 Relative abundance of gut microbiota in mouse at the revel of genus

3 结论与讨论

肥胖是一种常见的代谢疾病，伴随着许多健康问题，并可以增加II型糖尿病和相关代谢紊乱的风险[15]。近年来，越来越多的研究表明肠道微生物菌群多样性和组成变化与肥胖及其并发症之间存在着不可分割的联系[16]。多酚是茶叶中的主要活性成分，可改善脂质代谢紊乱，高血压和代谢综合征，发挥类似益生元作用[17-18]，有效缓解肥胖引起的肠道菌群失调，调节短链脂肪酸(Short- chain fatty acids, SCFAs)水平和脂质代谢[19]。虽然之前的研究表明乌龙茶儿茶素可以在体外抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖和脂肪形成[10]，但OTP在体内的减重机制仍然未知。因此，本文采用高通量测序技术研究OTP对肠道微生物菌群结构的影响。

本文研究结果表明，OTP对宿主肠道微生物菌群的调节具有时间效应。OTP改善了HFD喂养诱导的肠道菌群失调。在门的水平，在试验进行的第8周，OTP显著降低了HFD喂养的小鼠的F/B比率，该比率的增加通常被认为是“肥胖肠道微生物群”标志[20]。这可能是因为多酚及其代谢物在肠道中促进Bacteroidete繁殖的同时抑制了Firmicutes的生长。茶儿茶素在某些有益细菌上表现出与低聚果糖类似的增殖作用，同时在体外抑制溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)和Clostridium的生长。此外，它促进了总SCFAs的产生[21]。SCFA的产生是肠道微生物群代谢的结果。这些SCFA被认为可以促进纤维摄入，促进结肠健康和代谢健康，而SCFA在调节宿主代谢，免疫系统和细胞增殖方面起着关键作用[22]。在我们的研究结果中，在补充OTP的HFD喂养的小鼠中，产生SCFA的微生物菌类Bacotoides，Blautia和Ruminococcus的相对丰度增加。此外，在第8周，OTP显著增加了Alistipes，Barnesiella，Bifidobacteria和Lactobacillus的相对丰度，尤其是Bifidobacteria和Lactobacillus被认为是与人类健康最重要的菌群。Bifidobacteria已被证明可增强肠屏障功能，刺激宿主免疫系统，预防腹泻或过敏，参与维生素激活和调节脂质代谢[23]。先前已经表明Prevotella与西方饮食中的碳水化合物比例相关，并且与慢性炎症状况相关[24]。在我们的研究中，随着OTP的摄食，Prevotella的相对丰度逐渐降低，在8周时达到最低值(18.08 ± 0.03)。

综上所述，OTP能缓解高脂饮食诱导的肥胖，降低体重和体内脂肪含量，而这可能与OTP可以提高小鼠肠道菌群多样性和特定菌群的相对丰度有关。因此，OTP可能具有益生元活性，可用作功能性食品成分，具有治疗肠道微生物群的潜在治疗效用，对提高人体健康具有重要意义。