响应面法优化提取宽叶独行菜总黄酮工艺研究

李威霖，钟江斌，赵乙桦，陈成标，达娃央宗，都玉蓉，马建滨

(青海师范大学生命科学学院，青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海 西宁810000)

宽叶独行菜(LepidiumlatifoliumL.)是十字花科独行菜属多年生草本植物，全草入药，有清热燥湿的作用[1]。因它有较强的抗逆性，国外研究者常把宽叶独行菜视为外来侵略性杂草[2]。目前研究显示，利用GC-MS技术对宽叶独行菜的脂肪酸成分进行分析，其中乙醇提取物的石油醚萃取部位的棕榈酸含量达到53.98%，硬脂酸含量在17%以上[7]；宽叶独行菜具有驱虫、抗菌的作用，对胃肠道疾病具有一定治疗作用[3-6]。主要因其富含生物活性化合物，如山奈酚、槲皮素、槲皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等黄酮类化合物[8-9]。黄酮类化合物具有抑菌、抗疲劳、抗氧化、降血脂、抗肿瘤等生物活性，已广泛运用于临床医疗[10-14]。

超声波提取技术具有耗时短、提取率高、过程方便及费用低等特点，在植物学和天然产物化学等领域应用广泛[15-16]，本实验利用溶剂乙醇对宽叶独行菜进行超声波辅助提取。此法可以显著地缩短提取时间提高黄酮的提取率。通过单因素试验和响应面分析法，筛选超声辅助提取宽叶独行菜总黄酮的最优提取工艺，以期为宽叶独行菜中有效成分的开发利用提供参考依据。

1 材料与设备

1.1 实验材料

原料：宽叶独行菜(2017年6月采自青海省海西州乌兰县农田及周边)，样品标本由中国科学院西北高原生物研究所吴玉虎研究员鉴定。宽叶独行菜样品自然阴干后粉碎，过15目筛。

1.2 实验试剂与仪器

芦丁标准品：上海源叶生物科技有限公司；亚硝酸钠(分析纯)：天津市东华试剂厂；硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇(分析纯)：天津市凯信化学工业有限公司。

G-9紫外分光光度计：南京菲勒；CA-1115A冷却水循环机、N-1100V-WD旋转蒸发仪：东京理化；D2021高速离心机：北京刻薄赛尔上海萌睿生物科技有限公司；mL204/02万分之一天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；JP-060ST超声波清洗器：深证市洁盟清洗设备有限公司；ZN-200A微型高速粉碎机：中南制药机械厂。

2 实验方法

2.1 芦丁标准品溶液的制备与标准曲线的绘制

称取经75℃干燥的芦丁标准品5 mg于烧杯中，70%乙醇溶解并定容至50 ml容量瓶中，配制成浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。

分别吸取芦丁标准溶液：0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于10 mL试管中，加入30%乙醇溶液至6 mL，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，震荡摇匀后放置5 min，加入10%AgNO3溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min，加入2 mL 1.0 mol/LNaOH溶液，用30%乙醇定容至10 mL，摇匀后放置15 min，从中吸取一定量的溶液加入比色皿，检测芦丁标准液510 nm波长的吸光度。图中横轴为芦丁标准液的不同浓度值，纵轴为不同浓度值对应的吸光度值，计算相关系数(R)。

2.2 黄酮含量计算

总黄酮含量M(mg/g)=a×c×V/W

(公式1)

其中a为稀释倍数，c为黄酮浓度(mg/mL)，V为提取液体积(mL)，W为宽叶独行菜草粉质量(g)。

2.3 精密度实验

取10份质量为2.0 g的宽叶独行菜粉末，分别加入体积浓度为50%乙醇溶液，密封后在70℃超声辅助萃取60 min；按照NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定最吸光度，由回归方程及公式1计算出其中总黄酮含量。

2.4 加样回收实验

取5份质量为2.0 g的宽叶独行菜粉末分别加入体积浓度为50%的水-乙醇溶液，密封后在40℃超声辅助萃取30 min；在70℃下超声提取60 min，抽滤、减压蒸馏浓缩至一定体积；按照NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法，在最大吸收波长510 nm下测定吸光度，由回归方程计算出其中总黄酮浓度c1，之后，往其中加入预先配置好的浓度(c0)30.00 mg/L标准液等体积，混合均匀之后测得其吸光度，依据回归方程及公式1求出其中总黄酮含量(c2)，换算后可依据计算加样回收率。

加样回收率计算公式：

s=(c1-c2)/cn×100%

(公式2)

其中c1为提取液中总黄酮的浓度；c2为加入标准液之后溶液的浓度；cn为加入的标准溶液浓度；s为回收率。

2.5 单因素实验

2.5.1 乙醇浓度对宽叶独行菜总黄酮提取效果的影响

称取2.0 g的宽叶独行菜待测样品7份，在料液比1:15(mL/g)，提取温度60℃，提取时间60 min，超声功率为360 W的固定条件下，考察不同浓度(30%、40%、50%、60%、70%、80%和95%)的乙醇溶液对宽叶独行菜总黄酮提取量的影响。

2.5.2 提取时间对宽叶独行菜总黄酮提取效果的影响

称取2.0 g的宽叶独行菜5份，在料液比1∶15(mL/g)，乙醇浓度60%，提取温度60℃，超声功率为360W的固定条件下，考察不同提取时间(30 min、60 min、90 min、120 min、150 min)对宽叶独行菜黄酮提取量的影响。

2.5.3 液料比对宽叶独行菜中总黄酮提取效果的影响

称取2.0 g的宽叶独行菜5份，在乙醇浓度60%，提取时间60 min，提取温度60℃，超声功率为360 W固定条件下，考察不同液料比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)对宽叶独行菜黄酮提取量的影响。

2.5.4 提取温度对宽叶独行菜中总黄酮提取效果的影响

称取2.0 g的宽叶独行菜5份，液料比1∶15(mL/g)，在乙醇浓度60%，提取时间60 min，超声功率为360 W的固定条件下，考察不同提取温度(40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)对宽叶独行菜黄酮提取量的影响。

2.6 响应面法优化宽叶独行菜总黄酮提取实验

参照预实验结果，选择黄酮的提取量为响应值，提取时间、乙醇浓度、提取时间、液料比为自变量；意单因素分析的不同实验结果确定不同单因素的最佳实验条件。利用Expert Design 8.0.3进行Box-Behnken响应面分析试验，设计四因素三水平的实验方案(表1)。

表1 响应面因素水平编码表Table 1 Factors and levels of response surface design

3 实验结果与分析

3.1 芦丁标准曲线

在波长510 nm处测得吸光度值为纵坐标，芦丁标准品的质量浓度为横坐标，绘制相应的标准曲线。芦丁标准曲线回归方程：y=12.165x+0.0007，R2=0.9996。结果表明，黄酮含量在0-0.06 mg/mL范围内，线性拟合良好。

图1 芦丁溶液标准曲线Fig.1 The standard curve of rutin solution

3.2 精密度实验结果

表2 宽叶独行菜中总黄酮的精密度实验结果Table 2 The results of precision test in Lepidium latifolium L.

3.3 加样回收实验结果

由表3可以看出，其回收率在95%-102%之间，具有较好的回收率，实验结果符合准确度的要求。

表3 加样回收率实验结果Table 3 Additive recovery test results

3.4 单因素实验结果

3.4.1 不同乙醇浓度对宽叶独行菜总黄酮提取量的影响

从图2看出，当乙醇浓度在30%-70%时，宽叶独行菜中总黄酮提取量随着乙醇度的提高而增大；当达到80%-90%时，总黄酮提取量下降，可能是由于乙醇浓度过高，黄酮苷类在高浓度乙醇中溶解性降低，进而导致总黄酮提取量减少；因此70%的乙醇浓度为提取总黄酮的最佳浓度[17]。

图2 不同乙醇浓度下宽叶独行菜黄酮的提取量Fig.2 Extraction yield of flavonoids from lonicera chinensis with different ethanol concentrations in Lepidium latifolium L.

3.4.2 不同提取时间对宽叶独行菜总黄酮提取量的影响

从图3可以看出，当提取时间在30-90 min时，宽叶独行菜中总黄酮提取量随时间增加而增加，而当提取时间超过90 min时提取的总黄酮含量有所下降。因此推断，适当的提取时间可以使宽叶独行菜中总黄酮充分溶解到提取液中，但提取时间过长时，部分黄酮类物质在高温环境下会发生结构变化，从而导致提取效果降低[18]。因此提取时间选择90 min左右。

图3 提取时间对宽叶独行菜黄酮提取量的影响Fig.3 Effects of extraction time on extraction yield of flavonoids in Lepidium latifolium L.

3.4.3 不同液料比对宽叶独行菜总黄酮提取量的影响

营运能力可从市场营销能力和产品/服务能力两个方面来衡量。企业的营销能力主要指企业是否能够吸引新客户、维持老客户。B2C企业的产品存在于虚拟网站空间，未直接面向客户，因此对消费者的推广营销、对于顾客的消费偏好、潜在消费者的挖掘等对企业成长方向确定产生关键性的作用。产品服务能力是影响B2C企业最关键的要素，是企业价值构造和品牌认知形成的主要手段。因为产品和服务是B2C企业同顾客之间发生关系的纽带和桥梁，企业通过产品和服务的全面性、优质性、独特性来吸引消费者产生偏好和忠诚进而对企业认识、认同和支持，从而扩大市场份额，给企业带来利润。

从图4中可以看出，当液料比从10:1(mL/g)增加到25:1时，宽叶独行菜总黄酮的提取率有显著提升，可能是由于当液料比较低时，少量的提取溶剂无法完全将宽叶独行菜中的总黄酮完全溶解出，随着提取液中总黄酮的浓度不断提高，样品中总黄酮向提取溶剂的转移速率下降。当提取液中总黄酮浓度饱和时，或样品中总黄酮浓度小于提取液中总黄酮浓度时，其提取效果变无法进一步提高。当液料比在20:1-30:1时，总黄酮的提取量略有下降，但变化幅度不大，因此可认为基本达到完全提取的效果。故液料比选择25:1。

图4 不同液料比对宽叶独行菜黄酮提取量的影响Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on extraction yield of flavonoids in Lepidium latifolium L.

3.4.4 不同提取温度对宽叶独行菜总黄酮提取量的影响

从图5中可以看出，当提取温度为40℃-70℃时，宽叶独行菜中总黄酮的提取量随着温度的升高而增加，当温度超过70℃时，总黄酮的提取率略有下降，可能是因为温度过高对部分黄酮类物质起到一定的分解破坏作用而导致提取效果下降，因此提取温度选择70℃。

图5 不同提取温度对宽叶独行菜黄酮提取量的影响Fig.5 Effects of different extraction temperature on extraction rate of falvonoids in Lepidium latifolium L.

3.5 Box-Behnken 响应面试验结果与分析

3.5.1 响应面试验结果

使用Design Expert 8.0.3软件，依照响应面Box-Behnken方法设计出实验方案，测定每组实验条件下宽叶独行菜黄酮提取量，实验结果见表4，实验模型方差分析见表5。

表4 响应面实验设计及结果Table 4 Scheme and results of response surface design

表5 方差分析表Table 5 Analysis of variance

注：P<0.01，差异极显著**。

从表5可以看出：该实验模型的方差为89.01，且差异极其显著，表明该二次多项模型极显著；F失拟项= 0.68，P失拟项=0.6893>0.05，表明该模型的失拟性不显著；该模型的校正决定系数Adj R2=0.9778，表明该模型可以解释97.78%总黄酮紫外吸收值的变化，有变异总数的2.22%不能被该模型解释；该模型的确定系数R2=0.9889，表明该模型拟合度较好，存在的实验误差小，可应用该模型分析和预测从宽叶独行菜提取总黄酮的工艺条件。使用DesignExpert8.0.3软件对表2-7中实验结果进行多元回归拟合，最终得到不同自变量的一次效应，二次效应和交互效应的关联方程；即得宽叶独行菜中总黄酮的提取量(Y)与自变量乙醇浓度(A)、提取时间(B)、液料比(C)、提取温度(D)的二次方模型：

Y=35.39-0.057×A+1.13×B+1.22×C+2.33×D-1.74×AB-1.90×AC+1.82×AD+1.17×BC+0.095×BD-1.58×CD-2.40×A2-3.92×B2-1.23×C2-2.32×D2

3.5.2超声辅助提取宽叶独行菜总黄酮响应面法优化

利用Design Expert 8.0.3软件对回归方程和各因素之间的相互作用进行拟合分析，利用拟合出的响应面形状，分析提取条件，即A浓度、B时间、C液料比、D温度对黄酮提取量的影响，拟合结果如图6至图10所示。

由图6可知，乙醇浓度和提取时间交互作用结果显示，提取时间变化曲面比乙醇浓度变化曲面陡峭说明提取时间对宽叶独行菜黄酮含量的影响比乙醇浓度大；等高线呈椭圆形表明二者交互作用显著。在同一乙醇浓度下，随着提取时间的增加，黄含量也增加，在60-96 min时，升高较明显。在同一提取时间下，黄酮含量随着乙醇浓度的升高而增加，在60%-75%时，升高较明显[19]。

由图7可知，液料比变化曲面和乙醇浓度变化曲面相对比较平缓说明液料比和乙醇浓度对宽叶独行菜黄酮含量的影响不显著；等高线呈椭圆形表明二者交互作用显著。在同一乙醇浓度下，随着液料比的减少，黄酮含量也增加。在同一液料比下，黄酮含量随着乙醇浓度的升高先增加后减少，在65%-70%时有最大值。

由图8可知，提取温度比乙醇浓度对宽叶独行菜黄酮含量的影响大。在同一乙醇浓度下，随着提取温度的升高，黄酮含量也增加。在同一提取温度下，黄酮含量随着乙醇浓度的升高而增加。

由图9可知，液料比变化曲面比提取时间变化曲面陡峭说明液料比比提取时间对宽叶独行菜黄酮含量的影响大；等高线呈椭圆形表明二者交互作用显著。在同一提取时间下，随着液料比的减少，黄酮含量增加。在同一液料比下，黄酮含量随着提取时间的升高先增加后减。

由图10可知，提取温度变化曲面比液料比变化曲面陡峭说明提取温度比液料比对宽叶独行菜黄酮含量的影响大；等高线呈椭圆形表明二者交互作用显著。在同一液料比下，随着提取温度的升高，黄酮含量增加。在同一提取温度下，黄酮含量随着液料比的较少而增加。

图6 不同乙醇浓度和提取时间对宽叶独行菜黄酮提取量的交互影响Fig.6 The interactive effect of different ethanol concentration and extraction time on extracting flavonoids content in Lepidium latifolium L.

图7 不同乙醇浓度和液料比对宽叶独行菜黄酮提取量的交互影响Fig.7 The interactive effect of different ethanol concentrations and liquid-solid ratio on flavonoids content in Lepidium latifolium L.

图8 不同乙醇浓度和提取温度对宽叶独行菜黄酮提取量的交互影响Fig.8 The interactive effect of different ethanol concentration and extraction temperature on flavonoids content in Lepidium latifolium L.

图9 不同提取时间与液料比对宽叶独行菜黄酮提取量的交互影响Fig.9 The interactive effe9t of different extraction temperature and solid-liquid ratio on flavonoids content in Lepidium latifolium L.

图10 提取温度与液料比对宽独行菜黄酮提取量的交互影响Fig.10 The interactive effect of extraction temperature and solid-liquid ratio on flavonoids content in Lepidium latifolium L.

3.6 反应条件的优化验证

以DesignExpert 8.0.3软件计算二次方程模拟，将提取宽叶独行菜中总黄酮的实验参数确定为：75.36%乙醇、时间88.80 min，液料比22.48∶1，温度78.84℃；在该实验参数下，宽叶独行菜总黄酮提取量为36.71 mg/g。

由于实际操作条件与理论数据存在一定的差异，根据预测模型的理论最佳提取工艺条件将实际最佳工艺条件调整为：乙醇浓度75%，提取时间89 min，液料比22.5 mL/g，提取温度79℃。以调整后的工艺条件进行三次重复试验，所得的总黄酮提取量为36.5 mg/g，与模型预测的理论值存在0.25%的误差，证明使用相应面法所得到的最佳工艺条件具有一定的实用价值。

4 结论

本实验根据Box-Benhnken中心组合的试验设计原理建立宽叶独行菜总黄酮提取工艺的优化回归方程模型，经方差分析该模型拟合度较好。响应面法结果显示，提取温度、液料比、提取时间对总黄酮提取量影响极显著，而乙醇浓度的影响不显著。根据回归模型与验证实验，建立宽叶独行菜中总黄酮的最优提取工艺：料乙醇浓度75%，提取时间89 min，液料比22.5 mL/g，提取温度79℃，所得的总黄酮提取量为36.5 mg/g。