一株乳酸片球菌的筛选、鉴定及其固态发酵饲料原料的产酸分析

李慧芬， 王文博， 马 成

（1.青岛根源生物技术集团有限公司技术支持中心，山东青岛266111；2.青岛根源生物技术集团有限公司固体发酵实验室，山东青岛 266736）

乳酸菌被广泛应用于食品发酵、制造及医疗保健领域，其不仅具有良好的抑菌防腐功能，还具有改善食品风味、增强食品营养的作用（Reis，2012；Schnurer，2005）。 乳酸菌包括乳球菌（Lactococcus）、明串珠菌（Lactobacillus）、片球菌（Pediococcus）、 乳杆菌 （Leuconostoc） 和肉食杆菌（Carnobacterium）等属（凌代文等，1999）。

乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）属于硬壁菌门 （Firmicutes）杆菌纲 （Bacilli）乳杆菌目（Lactobacillales）气球菌科（Aerococcaceae）片球菌属（Pediococcus），其主要依赖碳水化合物作为碳源进行生长，可能以糖酵解途径产生D-乳酸或L-乳酸 （Nieto等，2006）。 乳酸片球菌能发酵产生有机酸、细菌素、环二肽、短链脂肪酸等多种抑菌物质（Wang，等，2014）。 目前，有关乳酸片球菌的研究多涉及细菌素的分离纯化及抑菌效果，关于其固态发酵饲料原料产酸的研究较少。因此，本研究从猪的新鲜粪便中分离纯化出一株具有较强产酸效果的乳酸菌，经形态、生理生化与分子鉴定，确定为乳酸片球菌，并对其发酵不同饲料原料的产酸效果进行分析，以期为该菌在固态发酵饲料原料中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 固态发酵原料 豆粕采用渤海46蛋白豆粕；麸皮采用二级小麦麸；玉米粉采用一级玉米粉；稻壳粉采用40目精致稻壳粉。固态发酵原料均来自根源生物技术集团固体发酵实验室。

1.1.2 MRS培养基 液体培养基：葡萄糖2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、乙酸钠0.5%、柠檬酸三铵0.2%、K2HPO4·7H2O 0.2%、吐温 80 0.1% 、MgSO4·7H2O 0.058%、MnSO4·H2O 0.025% 、pH 6.2；固体培养基：在液体培养基的基础上另加0.5%CaCO3、2%琼脂粉。

1.1.3 菌株的分离纯化 选取山东中慧昌乐猪场杜洛克猪新鲜粪便6份，各取1 g溶于100 mL无菌生理盐水中，取1 mL与9 mL无菌生理盐水混合，稀释10倍，依次在含9 mL无菌生理盐水的试管中梯度稀释到10-8稀释度。选取 10-5～10-8稀释度的菌液，从中吸取1 mL到无菌培养皿中，倾注至灭菌后冷却到45℃的MRS固体培养基，37℃恒温培养72 h，镜检排除产芽孢的菌，挑取透明圈较大的菌。乳酸菌的菌落很小，大约1～3 mm，圆形隆起，表面光滑，呈乳白色、灰白色或暗黄色，且菌落周围有透明的碳酸钙溶解圈。在含有MRS固体培养基的平板上，将筛选出的菌株进行划线纯化三次，确保菌落纯度。

1.1.4 乳酸菌的液体培养 接种每株菌的单菌落到MRS液体培养基中，50 mL磨砂口锥形瓶内装液量为30 mL，37℃静置培养24 h。

1.2 菌株固态发酵豆粕与产酸优势菌筛选 按1%接种比例，1：0.5的料水比，接种乳酸菌液到1000 g豆粕中，37℃恒温培养48 h。

1.3 产酸优势菌形态、生理生化与分子鉴定

1.3.1 产酸优势菌的形态与生理生化鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》，对产酸优势菌的菌落菌体特征、生理生化特性等进行测定。

1.3.2 产酸优势菌的16SrDNA序列分析 应用普通细菌基因组DNA提取试剂盒，提取产酸优势菌的DNA，并以其为模板，采用细菌通用引物27 F和 1492 R，进行16SrDNA PCR扩增 （王延华等，2005）。扩增条件：94℃预变性5 min，随后循环扩增35循环 （94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸60 s），最后72℃延伸10 min。PCR产物送青岛睿博兴科公司测序。将获得的16SrDNA的序列在NCBI官网上进行Blast比对，获得代表性模式序列，应用MEGA 4.0软件按照UPGMA法进行系统进化树构建（Tamura等，2007）。

1.4 产酸优势菌固态发酵饲料原料的产酸分析

1.4.1 产酸优势菌固态发酵饲料原料的条件 按1%接种比例，1：0.5的料水比，接种乳酸菌液到1000 g豆粕、麸皮、玉米粉或稻壳粉中，37℃恒温培养48 h。

1.4.2 产酸优势菌固态发酵料的指标测定 pH指标：取10 g发酵料，加50 mL纯净水，混合均匀后静置10 min，用PHS-3C型pH计（上海精科）测定发酵料pH指标。

L-乳酸指标：采用HPLC方法测定，取1 g样品加100 mL纯净水磁力搅拌1 h，取2 mL液体12000 r/min离心10 min，取上清液用0.22μm滤膜过滤。高效液相条件：流动相（50 mM磷酸二氢钾：乙腈=90：10）；流速：1.25 mL/min；C18 柱，紫外检测器，波长 210 nm；柱温箱：40℃；进样量：20μL（Jannicke等，2006）。

挥发性脂肪酸（VFA）指标：采用 SP-2100A气相色谱仪 （北分瑞利 ），毛细管柱型号 KBFFAP 30 m×0.32 mm×0.25μm，柱温 130℃，汽化温度 180℃，应用氢离子火焰检测器，检测温度180℃，载气为高纯氮气，通过内标法（巴豆酸）定量各组分（秦为琳等，1982）。

发酵0 h与48 h，分别测定发酵料的pH、L-乳酸与VFA指标，每组3个重复。

1.5 统计分析 试验数据经Microsoft Excel初步处理后，利用SPSS 16.0统计软件进行方差分析，如果方差分析结果差异显著，则采用LSD法进行多重比较，以P＜0.05为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 固态发酵豆粕的产酸优势菌筛选 从6个粪便样品中共获得20株乳酸菌，固体发酵豆粕48 h时的pH如图1，其中14号菌株的pH最低，为4.86，与其他组的固态发酵豆粕产酸效果差异显著（P＜0.05），命名该菌株为HF 14。

图1 不同菌株发酵豆粕48 h的p H

2.2 HF 14的形态、生理生化与分子鉴定

2.2.1 HF 14的形态与生理生化鉴定结果 产酸优势菌HF 14为革兰氏阳性菌，菌体呈乳白色，与碳酸钙形成的透明圈约6～9 mm，有较强的产酸能力。生理生化特性显示该菌不运动，不形成芽孢，菌体为球型，不成链状。该菌兼性厌氧，主要发酵单糖与双糖，葡萄糖产酸不产气，主要产物是乳酸盐。接触酶为阴性，氧化酶也为阴性。不还原硝酸盐，主要生长温度为35～40℃，50℃也能生长，在6.5%NaCl、pH 4.5条件下也能生长。具体的生理生化特性见表1。

表1 产酸优势菌HF 14的生理生化特征

2.2.2 HF 14的16SrRNA序列分析 产酸优势菌在通用引物27 F和1492 R的扩增下，得到1456 bp序列，并与GenBank数据库中的模式菌比对 ，该菌株的16S序列与Pediococcus acidilactici strain GL16的16S序列99%相似，MEGA系统进化树上也与该类菌亲缘关系最近，如图2。综合菌株HF 14的形态、生理生化、16SrDNA序列分析，初步鉴定该菌株 HF 14为乳酸片球菌。

2.3 HF 14发酵不同原料的产酸类别分析 由表2可知，四种饲料原料经乳酸片球菌HF 14发酵后，pH均显著下降（P＜0.05），尤其是麸皮，发酵后pH降幅达2.18。稻壳粉的起始pH较低，降幅也最低，仅1.27，但与发酵前相比，发酵后pH也显著下降（P＜0.05）。

图2 产酸优势菌HF 14的16S rDNA系统进化树

四种饲料原料经乳酸片球菌HF 14发酵后，L-乳酸含量均显著增加（P＜0.05），尤其是玉米粉，发酵后L-乳酸增幅达21.5。稻壳粉发酵前L-乳酸含量最低，发酵后比发酵前显著增加 （P＜0.05），但与其他原料相比，增幅最低，为5.31。

VFA是厌氧发酵过程中经水解阶段产生的乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸等挥发性脂肪酸的总和，但是在厌氧发酵中最主要的是乙酸，其次是丙酸与丁酸，其他的含量非常少，可忽略不计（Yuan等，2011）。本试验中，稻壳粉组发酵后乙酸含量显著增加（P＜0.05），增幅达5.73，显著高于其他饲料原料组，丙酸与丁酸含量无显著变化（P＞0.05），说明稻壳粉经乳酸片球菌HF 14发酵后产生的VFA以乙酸为主。豆粕、麸皮、玉米粉三种饲料原料经HF 14发酵后产生的VFA也是以乙酸为主，其次是丙酸，最后是丁酸，与发酵前相比，都有显著增加（P＜0.05）。三种饲料原料中，豆粕的初始乙酸含量较高，发酵后麸皮与玉米粉的乙酸含量增加较大；丙酸的初始含量无显著差异（P＞0.05），发酵后玉米粉的增幅最大；麸皮的初始丁酸含量较高，发酵后增幅也最大，其次是玉米粉。

表2 产酸优势菌HF 14发酵不同饲料原料的产酸类别分析

3 讨论

pH作为一个重要的环境因素，不仅能够影响微生物酶的活性，也能影响发酵产物的组成（Zhang，2009；Chen，2007；Horiuchi，2002）。稻壳粉发酵前pH为5.72，显著低于其他饲料原料（P＜0.05），发酵后产酸的VFA中乙酸占97.6%，在数值上甚至超过了L-乳酸（张玉静等，2013）。而乳酸可以被氧化为丙酮酸，进而脱羧转变为乙醛，再被氧化成为乙酸，推测稻壳粉经乳酸片球菌HF 14固态发酵过程中，最初产生的乳酸，部分发生了一系列生化反应转变为乙酸。豆粕、麸皮、玉米粉这三种饲料原料经乳酸片球菌HF 14发酵后产生的有机酸中，L-乳酸含量在数值上占较大优势。乳酸能维持动物肠道菌群平衡，减少腹泻，促进钙质的吸收。动物体内含有L-乳酸脱氢酶，只能分解自身产生或摄入的L-型乳酸 （Abdel等，2011）。 因此，高光学纯度的L-型乳酸更受市场青睐。乙酸是厌氧发酵过程中重要的中间代谢产物，是很好的抗微生物剂、酸度调节剂和酸味剂，但是有较为刺激的气味。不同原料发酵时乙酸也是重要的有机酸，如在畜禽粪便厌氧发酵系统中乙酸占 VFA 的 40%以上（NI，2011；Wu，2010），而秸秆厌氧发酵时，乙酸可以占到46%以上（Zhao等，2014）。丙酸是饲料、医药、食品工业等领域的重要原料，具有很好的防真菌和霉菌的作用，效果优于苯甲酸，是极佳的食品防腐剂 （徐亲民等，1997）。本试验中，乳酸片球菌HF 14发酵玉米粉的丙酸含量最高。丁酸是肠膜细胞的主要能量来源，还可促进肠黏膜修复及其功能恢复，并且能抑制炎症细胞因子的形成，从而起到抗炎症作用（胡仁伟，2003；Augeulieht，2002）。 然而，本试验中各组的丁酸含量都不高，最高的发酵麸皮仅0.72 mg/g。丁酸的生产需丁酸梭菌等特定菌的引入，且对代谢条件进行诱导干预。

同一株乳酸片球菌，采用同样的固态发酵工艺发酵不同的饲料原料，产生的有机酸以L-乳酸与乙酸为主，且不同的饲料原料发酵后有机酸的类别有一些差异。其中发酵玉米粉的pH最低，L-乳酸与丙酸含量最高;发酵麸皮的pH降幅最大，丁酸含量最高；发酵稻壳粉的乙酸含量最高，L-乳酸含量最低；发酵豆粕的各个指标居中。

4 结论

研究筛选到1株固态发酵豆粕产酸效果较强的菌，经鉴定为乳酸片球菌。对乳酸片球菌HF 14固态发酵豆粕、麸皮、玉米粉与稻壳粉的产酸类别进行分析发现，产生的有机酸以L-乳酸与乙酸为主，其中，发酵玉米粉的pH最低，为3.77，L-乳酸与丙酸含量最高，分别为21.91、1.03 mg/g；发酵麸皮的pH降幅最大，丁酸含量最高，为0.72 mg/g；发酵稻壳粉的乙酸含量最高，为6.15 mg/g，L-乳酸含量最低；发酵豆粕的各个指标居中。