黄曲霉毒素降解菌N-1a的降解特性及在全株玉米青贮中的应用

赵 杨， 要 灿， 郭晓军*， 赵蕊蕊,2， 张舒月， 毛思宇

（1.河北农业大学生命科学学院，河北保定071000；2.河北众邦生物技术有限公司，河北保定 071000）

在我国，玉米是重要的粮食和饲料作物之一，玉米粒的65%被用于饲料工业。随着畜牧养殖业的发展，玉米籽粒＋秸秆黄贮饲料的饲喂方式无法再提高肉、奶等畜产品质量（田吉鹏等，2017）。近几年，国家提出了“粮改饲”政策，提倡青贮全株玉米发展畜牧业。然而霉菌毒素的污染成为影响全株青贮发展的重要因素之一。青贮饲料中主要的霉菌毒素包括黄曲霉毒素 （AFB1）（Alonso等，2009）、伏马菌素（FBS）（Kim 等，2004）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇 （DON）（Van，2011） 和胶霉毒素（Keller，2012）等。其中黄曲霉毒素具有高毒性和致癌性，经过食物的直接摄入或进食黄曲霉毒素污染饲料的动物导致的间接摄入都会造成对人体的毒害作用。动物试验证明，黄曲霉毒素会严重影响动物生长发育（Dersjant等，2003）。急、慢性黄曲霉毒素中毒导致肉/蛋产量下降、免疫抑制和肝脏中毒（Khan等，2010）。人类黄曲霉毒素中毒根据接触水平产生不同的危害，高剂量会导致快速死亡，慢性中毒则引发肝细胞癌等（罗自生等，2013）。

本研究前期工作筛选到1株枯草芽孢杆菌N-1a（张舒月等，2018），该菌株既可以拮抗黄曲霉的生长，又可以降解黄曲霉毒素。本试验旨在研究黄曲霉毒素降解菌N-1a的降解特性及在全株玉米青贮中的应用效果，以期为菌株N-1a降解黄曲霉毒素的机制提供理论依据，并为新型青贮剂的研制提供新的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）N-1a，由河北农业大学制药工程实验室提供。

1.1.2 培养基 种子培养基：酵母膏 0.1%，葡萄糖 0.6%， 蛋白胨 0.1%，CaCO30.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.2～7.4，经121°C高温湿热灭菌15 min。

发酵培养基：玉米面 3.5%，蛋白胨 1.5%，Ca-Cl2·H2O 0.01%，MnSO40.1%，pH 6.0， 经 121 °C高温湿热灭菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株N-1a降解黄曲霉毒素活性物质的研究 参照雷元培等（2011）的方法，制备N-1a菌株发酵液、发酵上清液、胞内提取液、发酵上清液+蛋白酶K（37℃处理1 h）、发酵上清液+蛋白酶K+1.0%SDS（37℃处理6 h）、上清液沸水浴10 min。测定不同处理组对黄曲霉毒素的降解率，用于确定活性物质的性质。黄曲霉毒素的测定参照张舒月等（2018）的方法。

1.2.2 菌株N-1a在不同pH下对黄曲霉毒素的降解率 取等量N-1a菌株发酵上清液于6支试管中，添加黄曲霉毒素使其终浓度为1000μg/kg，然后分别调 pH 为 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。 在180 r/min、37℃摇床处理72 h后测定黄曲霉毒素残留量，以确定菌株N-1a在不同pH下对黄曲霉毒素的降解率。

1.2.3 菌株N-1a在不同温度下对黄曲霉毒素的降解率 取等量N-1a菌株发酵上清液于4支试管中，添加黄曲霉毒素使其终浓度为1000μg/mL，然后分别调温度为17、27、37、47℃。 在180 r/min摇床处理72 h后测定黄曲霉毒素残留量，以确定N-1a菌株在不同温度下对黄曲霉毒素的降解率。

1.2.4 功能菌株菌剂的制备 采用郑婧萱等（2018）优化的培养基在河北众邦生物技术有限公司进行中试生产，制备功能菌株的发酵液。

1.2.5 全株玉米青贮试验 将实验室摇瓶培养的黄曲霉均匀的混到揉丝的全株玉米中，然后等分为3份进行不同的处理，每个处理设三个平行。

处理1：直接装到5 kg的小白桶中，压实密封发酵。

处理2：按照109cfu/kg的接种量接种N-1a的发酵液，然后装到5 kg的小白桶中，压实密封发酵。

处理3：按照109cfu/kg的接种量接种市售的青贮菌剂（河南某公司，有效活性菌为植物乳杆菌和布氏乳杆菌），然后装到5 kg的小白桶中，压实密封发酵。

室温发酵45 d，发酵结束后近红外技术测定全株玉米青贮的指标。

2 结果与分析

2.1 菌株N-1a对黄曲霉毒素的降解特性研究

2.1.1 菌株N-1a降解黄曲霉毒素活性物质分析由图1可知，菌株N-1a的发酵液与发酵上清液对黄曲霉毒素的降解率分别为94.50%和85.71%，分别比胞内提取液的降解率高73.83%和65.04%，可以得出菌株N-1a对黄曲霉毒素的降解主要是通过分泌的胞外活性物质进行降解的，而非菌体吸附。而发酵上清液经蛋白酶K、蛋白酶K+1%SDS、加热等不同处理后，降解率分别比等体积的发酵上清液低55.51%、60.41%和75.51%，可以初步推测得出菌株N-1a降解黄曲霉毒素的活性物质为蛋白质类物质。

图1 菌株N-1a在不同处理下对黄曲霉毒素的降解率

2.1.2 不同pH下的降解率 由图2可知，菌株N-1a的发酵上清液随着pH的变化降解率也随之改变，在pH为7.0时其降解率为82.5%，降解率最高，而pH为9.0时降解率为33.63%，发酵上清液在pH为4.0时降解率为41.88%，由于该菌株可以在pH 4.0时很好的生长，所以该菌株可以在青贮pH较低的条件下发挥降解黄曲霉毒素的作用。

图2 菌株N-1a的发酵上清液在不同pH下对黄曲霉毒素的降解率

2.1.3 不同温度下的降解率 菌株N-1a的发酵上清液在不同温度下对黄曲霉毒素的降解率见图3。不同温度对菌株N-1a黄曲霉毒素的降解率影响不大。在37℃时最高，17℃和47℃的降解率都有所下降，但降解率与37℃时相差不大，可见该菌株满足北方低温条件和南方高温条件下的青贮去毒。

图3 菌株N-1a的发酵上清液在不同温度下对黄曲霉毒素的降解率

2.2 菌株N-1a在全株玉米青贮中的应用效果由表1可知，三个处理组之间的黄曲霉毒素含量均有显著差异，添加N-1a组的黄曲霉毒素残留量显著低于另外两个试验组。除此之外，添加N-1a组的NDF和ADF含量显著低于另外两个组，其中NDF比处理组1和处理组3分别低10.11%和7.98%；ADF比处理组1和处理组3分别低3.35%和2.72%。乳酸、乙酸的含量均显著高于另外两个组，其中乳酸比处理组1和处理组3分别高4.40%和1.66%；乙酸比处理组1和处理组3分别高1.32%和1.04%。说明菌株N-1a在降解霉菌毒素的同时也具有提高青贮饲料营养价值和适口性的作用。

表1 青贮玉米秸秆各项指标

3 讨论

青贮玉米中的黄曲霉毒素大多是在田间及贮藏过程中附着在玉米上的黄曲霉或寄生曲霉代谢产生的，正是由于黄曲霉毒素的毒性强、污染范围广，使得黄曲霉毒素成为了食物中危害最大的污染物（张盼等，2015）。由于具有不可避免和不可预测的特性，使其成为全株玉米青贮中一个很大的挑战。在黄曲霉毒素降解方面，目前应用的主要有乳酸菌、酿酒酵母、米曲霉等（朱新贵等，2001）。

本试验结果表明，枯草芽孢杆菌N-1a对黄曲霉毒素降解的活性组分是发酵上清液中的蛋白质类组分，可以断定黄曲霉毒素是被N-1a产生的代谢酶降解掉的，而不是简单的菌体吸附，这一点远远优于目前的市售产品。市售吸附毒素的菌剂在吸附毒素的同时会吸附一些营养成分，也不能彻底去除黄曲霉毒素的毒性，这使得青贮玉米的应用仍然受到很大的影响 （计成等，2010）。发酵上清液的降解活性受温度的影响不大，在不同温度下的降解率差异不显著。Smiley等（2000）研究的橙色黄杆菌蛋白质的粗提取物对黄曲霉毒素的降解率可达74.5%，但使用加热失活后的蛋白质对毒素的降解率仅为5.5%。而菌株N-1a在pH 4.0的时候仍具有40%以上的降解率，这些特性可以满足菌株N-1a在不同地域的青贮过程中发挥降解黄曲霉毒素的作用。本试验还进行了全株玉米的青贮试验，并对其发酵45 d后的秸秆进行毒素和营养物质的检测。结果表明，添加N-1a组的黄曲霉毒素显著低于未加菌剂的处理组1和添加市售菌剂的处理组3；从营养物质的检测结果中可以看出，在降解毒素的过程中并没有使秸秆中的营养成分流失，乳酸、乙酸的含量显著高于另外两个组，其中乳酸比处理组1和处理组3分别高4.40%和1.66%；乙酸比处理组1和处理组3分别高1.32%和1.04%。Van（1963)提出了用中性洗涤纤维（NDF)和酸性洗涤纤维（ADF)作为评定饲草中纤维类物质的指标。用ADF可以预测粗饲料的能量含量，NDF等常规营养可推测出干物质采食量。在开桶过程中添加N-1a组NDF和ADF的含量低于另外两个组，其中NDF比处理组1和处理组3分别低10.11%和7.98%；ADF比处理组1和处理组3分别低3.35%和2.72%。说明菌株N-1a在降解黄曲霉毒素的同时也具有提高青贮饲料营养价值和适口性的作用，能够使动物更有效的利用秸秆的营养物质。比较常见的降解黄曲霉毒素的乳酸菌制剂可以提高饲料中乳酸、乙酸的水平，促进粗纤维的转化，从而改善青贮饲料的发酵品质（兴丽等，2004；李军训等，2004)。但是乳酸菌是一类不形成芽孢的细菌，因此工业化生产不便保存和运输（吴逸飞等，2013)。而枯草芽孢杆菌是农业农村部允许直接添加到动物饲料中的有益微生物，生产简单、价格低廉，具有极强的抗逆性，能耐热、紫外线、多种溶剂、酸、碱等（杨立华等，2010）。因此菌株N-1a具有非常大的应用价值和广阔的应用前景。

4 结论

4.1 枯草芽孢杆菌菌株N-1a降解黄曲霉毒素的活性物质是该菌分泌的一种胞外蛋白，该蛋白质在不同pH和温度下均有活性，在pH 7.0和温度37℃时降解率最高。

4.2 枯草芽孢杆菌菌株N-1a可显著降低全株玉米青贮的黄曲霉毒素含量，还可显著降低NDF的含量、提高乳酸的含量。