大黄素增强索拉菲尼抗肝癌治疗作用的机制研究

王清清 张浩 曹浩强 俞清江

大黄素（Emodin,Emo）是从大黄、何首乌、虎杖等中药中提取出的一种蒽醌类单体化合物，具有抗癌（包括肝癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤）的药理学作用，同时对肝、肾有保护作用[1]。上皮-间充质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）参与肿瘤细胞的侵袭和转移的生物学过程，也是肿瘤耐药机制之一[2]。在先前的研究中本团队发现肝癌索拉菲尼（sorafenib,Sora）耐药细胞具有更强的耐药性及迁移和转移能力[3]，本研究将进一步探讨Emo是否能增强Sora抑制人肝癌Sora耐药细胞的活性和迁移能力及其机制，为提高Sora抗肝癌治疗的临床疗效提供思路。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂 人肝癌细胞HepG2和Huh7均购自上海中国科学院细胞库；Emo（批号：PRF8021741，纯度≥98%）购自成都普瑞法科技开发有限公司；Sora购自德国Bayer公司；FBS购自美国Gibico公司；药物细胞毒性实验（CCK8法）试剂盒购自日本Dojindo Laboratories公司；Western blot实验采用美国Bio-Rad电泳仪，试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；一抗兔抗人N-cadherin、Vimenti、GAPDH抗体均购自美国Cell Signaling Teclnology公司；二抗兔抗羊购自杭州联科生物技术股份有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；化学发光成像系统购自美国Syngene公司。

1.2 细胞培养与肝癌Sora耐药细胞株的构建 将人肝癌亲本细胞株Huh7和HepG2置于含10%FBS的高糖培养基（DMEM）中，在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，取处于对数生长期的细胞用于实验操作；Huh7R和HepG2R是经体外2μM的Sora低浓度开始诱导，持续1~2个月，逐步增加Sora药物处理浓度，直至达到细胞的最大药物耐受浓度所制成的耐药细胞，总诱导周期约6个月。

1.3 肝癌Sora耐药细胞的分组 根据处理因素的不同将两种肝癌Sora耐药细胞株分别分为对照组、Sora组、Emo组、Sora+Emo组，对照组不加入任何药物，Sora组加入浓度为2μM的Sora，Emo组分别加入浓度为25、30μM 的 Emo，Sora+Emo 组分别加入 2μM Sora、25μM Emo及 2μM Sora、30μM Emo。

1.4 细胞活性检测 采用CCK8法。取生长状态良好，处于对数生长期的人肝癌细胞，胰酶消化后用含5%FBS培养基重悬细胞（5×104/ml）后接种到96孔培养板中孵育过夜，丢弃旧培养液。先检测Sora半数抑制浓度（IC50）：Huh7、HepG2 和 Huh7R、HepG2R 细胞中加入不同浓度的 Sora（0、1、2、4、6、8、10、12μM），根据细胞存活率结果，应用GraphPad Prism5软件计算各组对Sora的IC50；再将在含5%FBS的培养基中继续培养48h的各实验组细胞除去培养液，每孔加入CCK8试剂与DMEM 1∶9混合液 100μl，置于 37℃孵箱中继续孵育 1~2h。使用酶标仪在450nm波长下测定液体的吸光度（A）值。每个实验组设置3个复孔，实验重复3次，取平均数。细胞存活率计算公式如下：细胞存活率（%）=[实验组（OD）-空白组（OD）]/[对照组（OD）-空白组（OD）]×100%。

1.5 细胞克隆形成能力检测 采用集落形成实验。将人肝癌Sora耐药细胞按照300个/孔的浓度接种到6孔板中。24h后，Sora组、Emo组、Sora+Emo组用含不同浓度药物的10%FBS培养液替换旧培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养10d。当细胞集落形成肉眼可见的克隆时，终止实验，丢弃旧培养液，甲醇固定20min，0.01%结晶紫染色20min，用相机拍照后计数细胞克隆数。

1.6 细胞迁移能力检测 采用Transwell迁移实验。取对数生长期的肝癌HepG2R和Huh7R细胞，用胰酶消化后用PBS清洗3次，用含2%FBS的DMEM培养液重悬细胞并计数；取 200μl细胞悬液（5×104个细胞/100μl）铺于小室上层，下室加入含不同浓度药物的20%FBS培养液；48h后取出Transwll小室，弃去小室中的培养液，预冷的PBS清洗3遍后用预冷的甲醇固定20min，0.01%结晶紫染色20min；PBS清洗小室，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜下随机挑选5个视野（×200），计数穿膜迁移的细胞数，取平均值。

1.7 EMT相关蛋白N-cadherin和Vimenti表达检测采用Western blot法，各实验组细胞经药物处理48h后，用预冷的PBS清洗3次，加入预先配制好的蛋白裂解混合液（RIPA裂解液∶蛋白酶抑制剂=100∶1）在冰上裂解30min；收集的细胞裂解液于4℃、12 000g/min离心15min，按照BCA定量说明书对上清液定量；加入5×loading buffer上样缓冲液，于100℃蛋白煮沸变10min；每实验组加入20~30μg蛋白，选择10%分离胶进行SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶）电泳，在100V电压及100min的湿转条件下将蛋白转至NC膜（硝酸纤维素膜）上，然后用含5%脱脂奶粉的封闭液于室温下孵育2h；加入相应的一抗稀释液（1∶1 000稀释）4℃孵育过夜，PBST缓冲液漂洗3次×15min，二抗稀释液（1∶1 000）室温孵育 2h，PBST 漂洗 3 次×15min；ECL发光液显影，化学发光成像系统采集图片，ImageJ软件分析灰度值，计算目标蛋白相对表达量。

1.8 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，两组比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌亲本细胞和Sora耐药细胞的IC50比较 Huh7的 IC50为 3.8±0.4，HepG2 为 3.5±0.3，Huh7R 为 5.6±0.8，HepG2R为9.0±1.1。HepG2R和Huh7R的IC50均明显高于HepG2和Huh7，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

2.2 不同浓度Emo和Sora处理后肝癌Sora耐药细胞存活率比较 Sora+Emo组的细胞存活率均明显低于对照组、Sora组及Emo组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见表1。

2.3 不同浓度Emo和Sora处理后肝癌Sora耐药细胞的克隆形成数目比较 Sora+Emo组的克隆形成个数明显低于对照组、Sora组及Emo组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见图 1、表 2。

表1 不同浓度Emo和Sora处理后肝癌Sora耐药细胞的存活率比较（%）

2.4 不同浓度Emo和Sora处理后肝癌Sora耐药细胞的迁移数目比较 Sora+Emo组的细胞迁移个数明显低于对照组、Sora组及Emo组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见图 2（见插页）、表 3。

图1 Emo和Sora抑制肝癌Sora耐药细胞的克隆形成

表2 不同浓度Emo和Sora处理后肝癌Sora耐药细胞的克隆形成数目比较（个）

2.5 不同浓度Emo和Sora处理后肝癌Sora耐药细胞的蛋白相对表达量比较 Sora+Emo组的间质标志物N-cadherin、Vimenti蛋白表达下降，相对蛋白表达量明显低于对照组、Sora组及Emo组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见图 3、表 4。

3 讨论

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其病死率高居全球第2位[4]。手术切除是治疗早期肝癌的首选方法，但是往往很多患者发现时已是晚期，失去了根治性切除的机会。Sora是唯一被美国食品药品监督管理局批准用于治疗晚期肝癌的一线分子靶向药物，能有效抑制RAF/MEK/ERK介导的细胞信号传导通路而直接抑制肿瘤细胞的增殖，还可通过抑制血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR）和血小板衍生生长因子（PDGF）受体而阻断肿瘤新生血管的形成，间接地抑制肿瘤细胞的生长，但是只能够延长患者3个月的生存期[5]。一些学者通过体外实验研究发现长时间的Sora刺激可导致肝癌细胞对其产生耐药性[3，9]。可见Sora的长期应用容易产生获得性耐药，限制了其临床疗效。因此，探索肝癌Sora耐药机制已成为当前研究的热点。

表3 不同浓度Emo和Sora处理后肝癌Sora耐药细胞的迁移数目比较（个）

图3 Emo和Sora处理后肝癌Sora耐药细胞的蛋白电泳图

表4 不同浓度Emo和Sora处理后肝癌Sora耐药细胞的蛋白相对表达量比较

Emo是中药大黄的有效成分之一，通过调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭相关基因来抑制肿瘤的生长和转移。Kim等[6]的研究提出Emo能够通过抑制胆固醇代谢来增强Sora对肝癌细胞的抗肿瘤活性，同时也有学者通过体外实验研究提出Emo不仅能够抑制肝癌的生长，而且对小鼠肝、肾功能无明显影响，预示着Emo是一种的安全、有效的药物[7]。因此，目前研究认为Emo能作为肿瘤联合化疗的辅助用药。

国内外相关研究表明，EMT是肿瘤生长和侵袭的分子机制之一，其特点表现为上皮细胞失去基底侧极性和细胞间的黏附力，间叶细胞获得更强的侵袭和转移能力的生物学过程，被认为与肿瘤的侵袭及转移相关[8]。van Malenstein等[9]研究提出肝癌Sora耐药细胞发生EMT，而且具有更强的迁移和侵袭能力。在本研究团队先前的实验中已证实肝癌Sora耐药模型发生EMT[3]。同时，一些学者提出肿瘤细胞的EMT对细胞毒性药物和分子靶向药物的耐药性起着关键作用，其中包括肝癌Sora耐药[10-11]；因此，靶向EMT为研究切入点，是逆转肿瘤细胞耐药、提高临床疗效的新型研究方向。本研究通过长期低浓度Sora诱导成功构建人肝癌Sora耐药细胞模型，发现Emo联合低浓度Sora能够有效抑制其增殖及克隆形成，较单一药物处理具有更强的抗肿瘤活性；同时，Emo联合低浓度Sora作用人肝癌Sora耐药细胞，与单一药物处理组相比，细胞迁移数明显下降，提示联合用药能显著抑制耐药细胞的迁移。通过深入研究显示，联合用药能够明显抑制上皮标记蛋白N-cadherin、Vimenti的表达，证实Emo联合低浓度Sora对耐药细胞的增殖抑制、迁移抑制与EMT相关。

当然，本研究也有一定局限性，没有构建相对应的动物实验模型，但是从目前的研究中本研究团队总结如下：（1）Emo联合低浓度Sora能够增强Sora的药物敏感性，增强其抗肿瘤活性；（2）Emo联合低浓度Sora能够抑制耐药细胞的迁移；（3）Emo可能通过抑制EMT来影响其生物学行为。