直肠癌组织中miR-144、ROCK-1 mRNA表达变化及其意义

宋志岗，刘帅，郭静华，连彦军，宋炳辉

(1 邢台市第三医院，河北邢台054000；2 邢台市第五医院)

直肠癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤，近年来随着人们饮食结构的改变，发病率与死亡率有逐渐升高的趋势，严重危害我国人民健康[1]。手术治疗、化疗等是目前主要治疗方案，但直肠癌晚期患者的恶性程度高，治疗效果不理想，预后较差，因而，有必要深入研究其发生发展的分子机制[2]。微小RNA(miRNA)是一类小型内源性非编码RNA，长度约18～25 bp，参与细胞分化、细胞周期及凋亡调控，还可参与炎症、免疫及肿瘤恶性进展等过程[3]。研究[4]发现，直肠癌组织中存在多种miRNA的异常表达，其可通过结合下游靶基因mRNA的3′端非翻译区改变mRNA的稳定性，影响靶基因的表达，参与肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等恶性生物学过程。有研究[5]报道，检测粪便中miR-144表达水平有助于早期诊断结直肠癌。研究[6]表明，miR-144是细胞分化、增殖、凋亡及浸润转移过程中的关键调节因子，可在转录后及翻译水平调节多种靶基因的表达，而在高级别、进展期恶性肿瘤中，肺腺癌转移相关转录本1作为一种内源竞争性RNA，可进一步抑制miR-144的表达，促进肿瘤细胞的增殖和远处转移，与患者不良预后密切有关。研究[7]结果发现，miR-144作为一种肿瘤抑制性miRNA，可抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡和自噬。Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在小GTP酶RhoA的下游起作用。ROCK的不同亚型与多种细胞功能有关，包括平滑肌收缩、细胞分裂、细胞黏附和运动，其中ROCK-1是介导RhoA信号的关键介质，参与细胞收缩、细胞凋亡、迁移和侵袭的信号传导调节。有研究[8]表明，乳腺癌细胞中RhoA激活ROCK-1可促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。因而，miR-144对直肠癌进展的抑制作用可能与ROCK-1有关。本研究通过检测直肠癌组织中miR-144、ROCK-1 mRNA的表达情况，分析两者间的相关性及与直肠癌患者临床病理参数的关系，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年5月～2018年10月在邢台市第三医院诊治的直肠癌患者100例，其中男63例、女37例，年龄31～74岁，平均年龄(54.10±6.71)岁；伴远处转移者22例、无远处转移者78例，肿瘤直径<5 cm者66例、≥5cm者34例，肿瘤分期Ⅰ期21例、Ⅱ期30例、Ⅲ期23例、Ⅳ期26例，病理分化为高分化者41例、中分化者32例、低分化者27例。所有患者均接受手术切除治疗，术中留取癌组织及癌旁组织置于冻存管中，液氮速冻后，转运至实验室置于-80 ℃冰箱保存。纳入标准[9]：①经肠镜活检和(或)术后病理检查诊断为直肠腺癌。②所有患者均为首次诊治，既往未接受过放化疗及靶向药物治疗。③临床病理资料完整，患者及家属均知情同意并签署知情同意书。排除标准：①患者有炎性肠病、胰腺炎等消化系统疾病病史。②合并感染性疾病，如急性泌尿系感染、结核菌感染等。③合并其他器官恶性肿瘤。④病理学诊断不明确或临床病理资料不完整。本研究经本院伦理委员会审核批准通过。

1.2 直肠癌组织及癌旁组织中miR-144、ROCK-1 mRNA检测方法 采用qRT-PCR法。取20～30 mg的组织标本，TRIzol法提取组织中总RNA。以总RNA为模板，用Taq Man反转录试剂盒进行逆转录合成cDNA，反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。实验步骤严格按照反转录试剂盒说明书进行。PCR引物和探针均购自ABI生物公司。引物序列如下：miR-144正向引物为5′-GCTGGGATATCATCATATACTG-3′，反向引物为5′-CGGACTAGTACATCATCTATACTG-3′；ROCK-1正向引物为5′-AAG AGAGTGATATTGAGCAGTTGCG-3′，反向引物为5′-TTCCTCTATTTGGTACAGAAAGCCA-3′；内参基因β-actin正向引物为5′-GGTGATCCACATCTGCTGGAA-3′，反向引物为5′-ATCATTGCTCCTCCTCAGGG-3′。荧光定量PCR反应条件为：95 ℃ 20 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环。反应均在ABI7500实时定量PCR仪上完成，每个样本重复3次。以2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 直肠癌组织与癌旁组织中miR-144、ROCK1 mRNA表达比较 直肠癌组织中miR-144、ROCK-1 mRNA的相对表达量分别为0.48±0.06、0.96±0.20，癌旁组织中miR-144、ROCK-1 mRNA的相对表达量分别为0.98±0.07、0.24±0.12，两者相比，P均<0.05。

2.2 直肠癌组织中miR-144、ROCK-1 mRNA表达的相关性 直肠癌癌组织中miR-144、ROCK-1 mRNA表达呈明显负相关(r=-0.683，P=0.002)。

2.3 miR-144、ROCK-1 mRNA表达与直肠癌患者临床病理参数的关系 结果见表1。miR-144、ROCK-1 mRNA表达与直肠癌患者肿瘤分化和肿瘤分期有关(P均<0.05)。

表1 miR-144、ROCK-1 mRNA表达与直肠癌患者临床病理参数的关系

3 讨论

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，2012年我国结直肠癌发病人数达到25.3万例。直肠癌晚期患者或直肠癌术后复发、转移的患者肿瘤特异性死亡率较高，预后较差[10]。因此有必要对直肠癌的发生和发展机制进行深入探讨。近年来研究[11]表明，直肠癌中存在多种miRNA的表达异常改变，但它们在直肠癌发展和进展中的潜在分子机制仍未完全阐明。因此，有必要研究参与直肠癌进展的miRNA的功能，寻找潜在的靶基因，以寻找调控肿瘤发展的关键节点，为直肠癌诊断和治疗提供新的研究思路。

miR-144位于人类染色体17q11.2，其基因包含一个外显子，最早在红细胞中发现，其参与红细胞谱系成熟的调节。此外，在胰腺癌[12]、胃癌[13]和甲状腺癌[14]等多种肿瘤中也存在miR-144表达下调的现象，其可通过结合富含脯氨酸的蛋白11(PRR11)3′端非编码区，抑制PRR11的表达。此外，miR-144还可通过丝裂原活化蛋白激酶途径，促进Jun氨基末端激酶和p38的磷酸化，下调细胞外信号调节激酶的表达，最终抑制细胞凋亡和促进细胞增殖。在本研究中，直肠癌组织中miR-144的相对表达量显著低于癌旁组织，与以往报道[15]一致。目前其具体机制尚不清楚，可能与miR-144基因位点杂合性缺失有关，也可能与miR-144基因表观遗传学修饰后功能失活有关。此外，本研究中miR-144的表达与直肠癌患者的肿瘤分化、肿瘤分期有关，提示miR-144表达与肿瘤的发生发展有关。

肿瘤细胞的浸润和转移能力是癌症的重要标志，这个过程需要通过细胞骨架系统的重塑和细胞及细胞外基质的接触来促进细胞运动。Rho家族的小GTP酶在调节肌动蛋白细胞骨架组织和运动中发挥了重要作用[16]。ROCK属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，其通过与Rho GTP酶的相互作用调节，通过磷酸化多种下游靶蛋白来促进肌动蛋白、肌球蛋白引起的收缩，进而控制细胞运动和转移。ROCK信号在肿瘤、糖尿病肾病等疾病中发挥重要的作用，其中ROCK-1是介导RhoA信号的关键介质，参与细胞收缩、细胞凋亡、迁移和侵袭的信号传导调节。本研究中，直肠癌组织中ROCK1 mRNA的相对表达量显著高于癌旁组织，表明直肠癌发生时ROCK-1表达增加。我们认为，ROCK1 mRNA的表达升高可能与抑制其表达的miRNA表达下调有关，使ROCK-1 mRNA稳定性增加[17]。此外，本研究中直肠癌组织中ROCK-1 mRNA的表达与肿瘤分化和肿瘤分期有关，提示直肠癌组织中ROCK-1的表达参与肿瘤的发生发展。研究[18]表明，P53基因作为一种抑癌基因，其突变或缺失多发生于高级别、进展期恶性肿瘤中，ROCK-1可作为p53的生理调节因子，与p53结合并调节其稳定性及表达，p53基因突变后失去与ROCK-1结合的能力，导致ROCK-1水平升高。

在体外细胞实验[19，20]中，通过在直肠癌细胞系SW837、SW1463细胞中过表达ROCK-1后，miR-144对肿瘤细胞的迁移和增殖的抑制作用得到逆转。本研究进一步研究直肠癌癌组织中miR-144与ROCK-1 mRNA表达的相关性，结果表明两者的表达呈负相关关系，其可能的机制是，miR-144通过下调ROCK-1的表达抑制直肠癌的增殖和转移能力。

综上所述，直肠癌组织中miR-144表达降低，而ROCK-1 mRNA表达升高，两者共同参与直肠癌的发生发展，可能成为直肠癌诊断、治疗及预后评估的新肿瘤标志物，但对于两者之间具体作用途径有待进一步研究。