腹腔注射帕立骨化醇的糖尿病肾病大鼠肾脏病理变化及自噬相关蛋白表达观察

刘莹，贾俊亚，林珊

(天津医科大学总医院，天津300052)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病严重的微血管并发症，是糖尿病患者最常见的死亡原因之一，其临床特点是持续性蛋白尿和肾功能进行性下降，最终不可避免地发展到终末期肾病(ESRD)[1]。Klotho蛋白是一种单次跨膜蛋白，在肾脏和脑高表达，肾脏低表达Klotho蛋白会促进肾脏纤维化，在DN肾小管上皮细胞上皮间充质转化(EMT)中起重要作用。Klotho蛋白还是自噬信号的重要调节者。微管相关蛋白1轻链3(LC3)是自噬体膜上的标记蛋白，胞浆中存在LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式。LC3蛋白在合成后C端就被相关蛋白酶切割变成LC3-Ⅰ。当自噬体形成后，LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ并保留在自噬体膜上，直到与溶酶体融合，因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值可以反映自噬水平的高低[2]。帕立骨化醇是具有生物活性的维生素D类似物，除了对慢性肾脏病患者继发性甲状旁腺功能亢进具有良好的疗效外，还具有肾脏保护作用。有研究[3]表明，帕立骨化醇可增加肾小管上皮细胞Klotho表达。Tan等[4]研究发现，帕立骨化醇能维持梗阻性肾病小鼠的E-钙黏蛋白(E-cadherin)、维生素D受体水平，抑制纤连蛋白及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ型mRNA的表达，抑制TGF-β1表达及细胞增殖、凋亡，抑制EMT，减轻肾间质纤维化，保护肾小管上皮细胞完整性。2016年1月6日～2016年4月20日，本研究通过链脲佐菌素(STZ)诱导制备DN大鼠模型，在此基础上给予帕立骨化醇腹腔注射治疗，观察大鼠肾脏病理变化及自噬相关蛋白(Klotho蛋白、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)表达情况，判断帕立骨化醇对DN大鼠肾损伤的改善作用。

1 材料与方法

1.1 大鼠、试剂及仪器 清洁级雄性SD大鼠18只，体质量约220 g，购自北京华阜康生物科技有限公司，饲养于天津医科大学实验动物中心。帕立骨化醇注射液购于意大利Abbott S.P.A公司，STZ购自美国Sigma-Aldrich生物技术公司，兔抗LC3单抗购自美国Cell Signaling Technology公司，兔抗Klotho多抗购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，兔抗E-cadherin多抗购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。血糖仪、血糖试纸购自上海罗氏诊断产品有限公司。

1.2 大鼠分组、DN模型制备、帕立骨化醇腹腔注射方法及标本留取 18只雄性SD大鼠随机分为对照组(A组)、DN组(B组)、DN+帕立骨化醇组(C组)，每组6只。参照文献[5]方法，B、C组大鼠采用一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg的方法制作DN模型，72 h后测空腹血糖(FPG)，FPG>16.7 mmoL/L认定DN模型制备成功。DN模型制备成功后，C组大鼠每周3次腹腔注射低剂量帕立骨化醇0.4 μg/kg，A、B组同期腹腔注射等量生理盐水。各组大鼠腹腔注射12周后，取内眦静脉血，放入代谢笼中禁食水并收集24 h尿液，然后处死大鼠，取大鼠肾脏组织分离肾皮质备检。

1.3 各组大鼠体质量、血肌酐(Scr)、FPG、尿蛋白测算 第12周末称量各组大鼠体质量；取内眦静脉血，采用苦味酸法检测大鼠Scr，采用快速血糖仪检测FPG；取收集的24 h尿液，采用比浊法测定尿蛋白。

1.4 各组大鼠肾组织病理形态学检查 采用六胺银(PASM)染色法。取大鼠肾脏组织分离肾皮质，固定、石蜡包埋、切片，PASM染色后，显微镜下观察。

1.5 各组大鼠肾小管间质E-cadherin检测 采用免疫组织化学法。取各组4 μm石蜡切片常规脱蜡至水，3% H2O2阻断，1% Triton X-100处理5 min，2% BSA封闭30 min，微波修复；滴加适当浓度稀释的一抗4 ℃过夜，加入HRP标记相应二抗37 ℃ 20 min，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。在显微镜下观察并拍摄照片保存，每张切片随机选取照片10副，采用Image ProPlus 6.0软件测量照片中阳性反应部位的累计光密度值(IOD)，以IOD值表示大鼠肾小管间质E-cadherin的表达相对表达量。

1.6 各组大鼠肾组织自噬相关蛋白检测

1.6.1 各组大鼠肾小管上皮细胞Klotho蛋白检测 采用免疫荧光法。取各组4 μm石蜡切片常规脱蜡至水，抗原修复，然后漂洗；2% BSA 37 ℃湿盒内封闭30 min，分别加1∶100稀释的Klotho 4 ℃孵育过夜；漂洗后加荧光标记的二抗抗体37 ℃湿盒中避光作用30 min；漂洗后甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察各组标本荧光强度，并进行半定量分析：无荧光(-)记为0，极弱的可疑荧光(±)记为0.5，荧光较弱但清楚可见(+)记为1，荧光明亮(++)记为2，荧光闪亮(+++～++++)记3～4。

1.6.2 各组大鼠肾皮质LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ检测 采用Western blotting法。RIPA缓冲液裂解冻存肾组织提取总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳分离，湿转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，加一抗4 ℃过夜，TBST缓冲液洗膜3次，二抗孵育2 h后洗膜3次，增强化学发光，以β-Actin为内参，采用FluorChem凝胶成像仪扫描成像，AlphaView软件定量分析。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量、Scr、FPG、尿蛋白比较 如表1所示，与A组相比，B、C组大鼠体质量降低，Scr、FPG及尿蛋白水平均显著升高(P均<0.05)；与B组相比，C组大鼠Scr及尿蛋白水平均显著降低(P均<0.05)。

表1 各组大鼠体质量、Scr、FPG、尿蛋白比较

注：与A组相比，aP<0.05；与B组相比，bP<0.05。

2.2 各组大鼠肾组织病理形态学变化 A组肾小球及肾小管间质无明显病理改变；B组肾小球体积增大，系膜细胞基质增多，肾小管细胞肥大，出现泡沫样变、小灶性萎缩、轻度炎性细胞浸润；C组肾小管及肾小管间质损害较B组明显减轻，肾小管萎缩及间质纤维化不明显，见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理形态(PASM染色，400×)

2.3 各组大鼠肾小管间质E-cadherin比较 A、B、C组大鼠肾小管间质E-cadherin相对表达量分别为222±37、139±19、192±38，组间相比，P均<0.05。

2.4 各组大鼠肾组织自噬相关蛋白检测结果比较

2.4.1 各组大鼠肾小管上皮细胞Klotho蛋白比较 A、B、C组大鼠肾小管上皮细胞Klotho蛋白荧光强度分别为3.5±0.3、1.5±0.3、2.8±0.6，组间相比，P均<0.05。

2.4.2 各组大鼠肾皮质LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比较 A、B、C组大鼠肾皮质LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ分别为1.5±0.2、1.0±0.2、2.8±0.6，组间相比，P均<0.05。

3 讨论

帕立骨化醇生物学活性与活性维生素D3相似，不仅能降低肾病患者尿蛋白水平，也能抑制肾成纤维细胞的增殖和转化，减轻肾间质纤维化[6]。Zhang等[7]研究显示，STZ诱导DN小鼠单用帕立骨化醇治疗，可通过抑制肾素转录而发挥肾脏保护作用，使用帕立骨化醇与氯沙坦联合治疗，完全避免了蛋白尿的发生，还能修复肾小球滤过屏障，减轻肾小球硬化。也有研究[3]表明，帕立骨化醇可增加肾小管上皮细胞Klotho蛋白的表达。

本研究中血尿生化指标检测结果表明，DN大鼠Scr、FPG、尿蛋白水平显著升高，体质量明显减轻，经过帕立骨化醇腹腔注射治疗后，C组大鼠Scr、尿蛋白水平显著降低，但体质量较B组无明显改变；结合PASM染色结果，B组大鼠DN病理改变明显，而C组肾小管及间质损害较B组减轻，这说明帕立骨化醇可抑制DN肾小管EMT，减轻蛋白尿，改善肾功能。

EMT参与器官、组织的再生及纤维化过程，还可以在恶性肿瘤不受控制的生长中见到。肾脏纤维化最终可导致肾脏功能受损甚至发展为ESRD，其特征包括肾小管上皮向间充质细胞转化即EMT[8]。人类肾脏纤维化中可见EMT，并且随着疾病的进展，EMT相关转录因子逐渐增强[9]。上皮细胞转变为间充质细胞的重要原因就是E-cadherin丢失[10]。E-cadherin在各种组织中表达，并参与依赖Ca2+的细胞与细胞之间的互相黏附、连接[11,12]。本研究中，B组E-cadherin表达较A组显著下降，但C组较B组明显升高，说明DN可通过调节E-cadherin的表达导致上皮细胞转变为间充质细胞，进而导致了肾小管萎缩及间质纤维化，而帕立骨化醇可缓解这一过程。

Klotho蛋白在肾脏和脑部表达最多，可通过多种形式发挥生物学功能，在抗老化、抗氧化、抑制细胞凋亡、调节Wnt信号传导及肾脏离子通道等多种生理和病理过程中发挥着重要作用[13,14]。钱盈盈等[15]研究发现，缺血再灌注急性肾损伤后小鼠肾组织Klotho蛋白表达显著下调，Klotho蛋白水平的下调可能与凋亡诱导的肾损害密切相关。在本研究中，B、C组Klotho蛋白表达均下降，但与B组相比，C组Klotho表达升高，说明DN可导致Klotho蛋白表达的下降，我们认为DN通过Klotho自噬信号降低了肾小管上皮细胞的自噬作用，进而导致了EMT的发生；而帕立骨化醇可通过抑制DN大鼠Klotho蛋白的表达下降，进而增强肾小管上皮细胞的自噬作用，从而达到预防DN大鼠肾间质EMT的目的。

自噬是溶酶体参与的降解细胞成分的一种途径，是细胞内维持自身稳态的重要调节机制[16,17]。随着人们对自噬的广泛研究，自噬在肾脏疾病中的作用逐渐引起关注。有学者报道[18]，DN动物模型甚至DN患者中发生肾小管上皮细胞自噬障碍，导致本该经自噬溶酶体途径降解的受损细胞器和胞浆成分等在细胞内累积，可能是加剧肾小管间质的损伤、细胞外基质增多的重要原因。Kitada等[19]研究发现，在DN大鼠肾组织中，近端肾小管细胞自噬受到抑制。本研究中，B组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值较A组明显降低，C组较B组升高，提示DN状态下肾小管自噬减低，而帕立骨化醇可上调自噬水平。

综上所述，帕立骨化醇能上调肾小管上皮细胞Klotho-自噬信号活性，进而增强DN大鼠肾小管上皮细胞内自噬作用，从而抑制肾小管上皮间充质转化，减轻蛋白尿，改善肾功能，延缓肾衰竭进展。