强直性脊柱炎患者外周血淋巴细胞亚群计数及百分比变化观察

张宇，马莉，沈雪，方宗宇，林晶

(1 贵州医科大学医学检验学院，贵阳550004；2 贵州医科大学附属医院)

强直性脊柱炎(AS)是一种主要侵犯脊柱、骶髂关节并可不同程度累及周围关节的慢性炎性自身免疫性疾病[1]。据统计，我国AS患病率在0.24%左右，多见于青年男性[2]。AS病因复杂，发病机制尚未明确，其发病可能与环境、感染、遗传以及自身免疫调节功能紊乱等因素有关[3]。淋巴细胞亚群是反映机体免疫功能的重要指标，其比例失衡及功能异常是自身免疫性疾病的发病因素之一。因此，对AS进行外周血淋巴细胞亚群检测，全面了解患者的免疫状态，对正确判断患者的病情尤为重要。本研究应用流式细胞术测算AS患者外周血淋巴细胞亚群T淋巴细胞(CD3+)、抑制性T细胞(CD3+CD8+)、辅助性T细胞(CD3+CD4+)、B淋巴细胞(CD3-CD19+)和NK细胞(CD16+CD56+)的细胞绝对计数及百分比，分析其与AS疾病活动度及炎性活动指标间的相关性，探讨淋巴细胞亚群在AS发生发展及病情活动监测中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2017年9月～2018年10月贵州医科大学附属医院收治的AS患者39例，记为AS组，男32例、女7例，年龄16～48岁(28.87±8.31)岁，病程1个月～22年，平均病程(5.17±5.52)年，人类白细胞抗原HLA-B27均为阳性，采用疾病活动指数评分表(BASDAI)对AS患者进行评分，平均(3.88±2.04)分。纳入标准：①符合美国风湿病协会(ACR)1984年修订的AS诊断标准[4]；②未接受过抗风湿药物及生物制剂等治疗的初诊患者。排除标准：①合并其他免疫相关性疾病和风湿性疾病；②合并血液系统及心、肝、肾等疾病患者；③妊娠期或哺乳期女性；④近期有感染史者。同期选取在贵州医科大学附属医院体检健康者41例，记为正常对照组，男33例、女8例，年龄18～45岁(27.05±6.63)岁。两组间年龄、性别资料具有可比性。本研究经贵州医科大学附属医院伦理学委员会批准，研究对象均告知研究内容并签署知情同意书。

1.2 仪器及试剂 FACSCantoTMⅡ流式细胞仪购自美国BD公司，WXH微型旋涡混合器购自上海跃进医疗器械厂，低速离心机购自上海手术器械厂，CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP-Cy5.5/CD4-PE-Cy7/CD19-APC/CD8-APC-Cy7六色组合荧光抗体购自北京同声时代生物技术有限公司，HLA-B27检测试剂盒、磷酸缓冲液(PBS)、FACSTMLysing solution红细胞裂解液以及TrucountTMTubes流式专用计数管均购自美国BD公司。

1.3 两组外周血淋巴细胞亚群细胞绝对计数及百分比测算 研究对象于清晨空腹状态下采集肘静脉血2 mL，EDTA-K2抗凝，收集血清50 μL，加入含6 μL淋巴细胞亚群组合抗体的流式专用计数管中，轻轻涡旋混匀，室温避光孵育30 min，加入10%红细胞裂解液2 mL，混匀后室温避光孵育10 min，待红细胞完全溶解后，涡旋混匀，上流式细胞仪检测，采用Canto自动软件计算各淋巴细胞亚群细胞绝对计数，并测算各淋巴细胞亚群细胞占总淋巴细胞的百分比。

1.4 两组外周血炎性活动指标红细胞沉降率(ESR)、超敏C反应蛋白(Hs-CRP)检测 研究对象于清晨空腹状态下采集肘静脉血5 mL，置于不添加抗凝剂的采血管中，3 000 r/min离心15 min，收集血清，采用魏氏法检测ESR，采用散射比浊法检测Hs-CRP。

2 结果

2.1 两组外周血淋巴细胞亚群细胞绝对计数及细胞百分比比较 两组外周血淋巴细胞亚群细胞绝对计数及细胞百分比比较见表1。由表1可知，与正常对照组相比，AS组患者外周血淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+细胞绝对计数均降低(P均<0.05)，CD3+CD4+、CD3-CD19+细胞百分比均升高(P均<0.05)，CD3+CD8+、CD16+CD56+细胞百分比均降低(P均<0.05)。

表1 两组外周血淋巴细胞亚群细胞绝对计数及细胞百分比比较

注：与正常对照组相比，*P<0.05。

2.2 两组外周血炎性活动指标ESR、Hs-CRP水平比较 AS组外周血ESR、Hs-CRP水平分别为(29.79±12.14)mm/h、(15.93±12.39)mg/L，正常对照组外周血ESR、Hs-CRP水平分别为(7.32±3.27)mm/h、(2.05±1.42)mg/L，两组相比，P均<0.01。

2.3 AS患者外周血淋巴细胞亚群细胞绝对计数及百分比与BASBAI评分、ESR水平、Hs-CRP水平的相关性分析结果 CD3+细胞绝对计数与Hs-CRP水平呈负相关(r为-0.471，P<0.05)；CD3+CD4+细胞百分比与BASDAI评分、ESR水平、Hs-CRP水平呈正相关(r分别为0.607、0.484、0.359，P均<0.05)；CD3+CD8+细胞绝对计数与BASDAI评分、ESR水平、Hs-CRP水平呈负相关(r分别为-0.546、-0.406、-0.526，P均<0.05)，CD3+CD8+细胞百分比与BASDAI评分、ESR水平呈负相关(r分别为-0.406、-0.331，P均<0.05)；CD3-CD19+细胞百分比与Hs-CRP水平呈正相关(r为0.374，P<0.05)；CD16+CD56+细胞绝对计数与BASDAI评分、ESR水平呈负相关(r分别为-0.574、-0.375，P均<0.05)，CD16+CD56+细胞百分比与BASDAI评分、ESR水平呈负相关(r分别为-0.445、-0.336，P均<0.05)。

CD3+细胞绝对计数与BASDAI评分、ESR水平无关(r分别为-0.285、-0.180，P均>0.05)，CD3+细胞百分比与BASDAI评分、ESR水平、Hs-CRP水平无关(r分别为0.214、0.111、-0.122，P均>0.05)；CD3+CD4+细胞绝对计数与BASDAI评分、ESR水平、Hs-CRP水平无关(r分别为0.012、0.099、-0.183，P均>0.05)；CD3+CD8+细胞百分比与Hs-CRP水平无关(r为-0.297，P>0.05)；CD3-CD19+细胞绝对计数与BASDAI评分、ESR水平、Hs-CRP水平无关(r分别为-0.042、0.067、0.050，P均>0.05)，CD3-CD19+细胞百分比与BASDAI评分、ESR水平无关(r分别为0.279、0.277，P均>0.05)；CD16+CD56+细胞绝对计数及百分比与Hs-CRP水平无关(r分别为-0.242、-0.111，P均>0.05)。

3 讨论

AS是一种好发于青年男性的慢性炎性自身免疫性疾病，以中轴脊柱、骶髂关节受累为主，可伴发外周关节表现，严重者可发生脊柱畸形和关节强直。AS临床多表现为中轴及外周关节病变，还可累及眼、心、肺、肾和胃肠道等外周组织和器官[5]。AS发病起初缓慢且不易察觉，然而随着病情的发展，症状逐渐加重，极大地提高患者的致残风险，严重影响患者的身心健康。关于AS的病因及发病机制目前尚不明确。大量实验[6]证明，AS发病机制与T淋巴细胞异常激活、细胞免疫调节功能紊乱、淋巴细胞亚群比例失衡或功能异常等因素有关。本课题组前期研究[3]发现，AS患者中存在CD4+T淋巴细胞亚群Th1、Th2、Th17细胞比例失衡，证实淋巴细胞免疫调节功能紊乱与AS有关。

淋巴细胞是构成免疫系统和执行免疫功能的主要细胞群体，根据淋巴细胞在免疫应答过程中的功能以及膜表面标志科将淋巴细胞亚群分为T淋巴细胞(CD3+)、B淋巴细胞(CD3-CD19+)和NK细胞(CD16+CD56+)，并根据表型是否表达CD4和CD8，将T淋巴细胞进一步分为辅助性T淋巴细胞(CD3+CD4+)和抑制性T淋巴细胞(CD3+CD8+)[7]。T淋巴细胞对调节机体免疫功能的稳定具有重要作用，其中CD3+CD4+T细胞具有辅助巨噬细胞活化和B细胞产生抗体等功能，起诱导细胞及体液免疫的作用，而CD3+CD8+T细胞则通过抑制T细胞活化和B细胞产生抗体，抑制细胞及体液反应。CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞之间的相互协调和制约能够产生适应性免疫应答，即可清除抗原又不损伤自身组织，其比例失衡是免疫性疾病介导组织损伤的一个重要因素。B淋巴细胞主要介导机体中的体液免疫反应，其在抗原的刺激下可分化为浆细胞，通过分泌抗体抵御抗原的侵袭，机体外周血中成熟B淋巴细胞水平失衡可以导致自身免疫性疾病的发生。NK细胞是T淋巴细胞、B淋巴细胞之外的第3类免疫细胞，是机体天然免疫系统的主要成员。NK细胞在调节自身免疫反应中起重要作用，通过释放细胞因子对机体免疫功能加以调节，可抑制B淋巴细胞的增殖和分化，调节机体体液免疫反应，同时对T淋巴细胞介导的细胞免疫也起调节作用。目前，淋巴细胞亚群异常与AS的关系研究结果报道不一。Wang等[8]研究发现，AS组患者及健康对照组外周血CD3+、CD3+CD8-、CD3+CD8+T淋巴细胞百分比和CD3+CD8-/CD3+CD8+细胞比值均没有明显的差异。而邓菊慧等[9]研究发现，AS组患者中CD3+CD8+细胞比例较正常对照组明显升高，CD4+/CD8+细胞比值倒置，而CD3+、CD3+CD4+细胞比例变化无统计学意义。本研究发现，与正常对照组比较，AS组患者外周血CD3+CD4+细胞百分比明显升高，而CD3+CD8+细胞百分比明显下降，细胞绝对计数显示CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞数量减少，表明AS患者机体内存在T淋巴细胞亚群失衡，导致T淋巴细胞免疫调节失衡，造成细胞介导的免疫损伤，这与国内学者徐文莉等[10]研究结果一致。另外，本研究发现，AS患者外周血CD3-CD19+细胞百分比明显升高，CD16+CD56+细胞百分比明显降低，细胞绝对计数显示CD16+CD56+细胞数量减少，CD3-CD19+细胞数量无明显变化，提示CD16+CD56+细胞减少，抑制功能相对不足，可能对CD3-CD19+细胞增殖分化的抑制作用减弱，从而导致AS患者中CD3-CD19+细胞异常活化发生过强的免疫反应，与大量分泌自身抗体的CD3-CD19+细胞出现可能有关。由此可见，AS患者体内不仅存在体液免疫的功能紊乱，而且细胞免疫中各种T细胞亚群计数和比例失衡在AS的发病也可能起着重要的作用。AS患者淋巴细胞亚群与BASDAI评分相关性分析结果显示，CD3+CD4+细胞百分比与BASDAI呈正相关，CD3+CD8+、CD16+CD56+细胞百分比及绝对计数与BASDAI呈负相关，提示淋巴细胞亚群表达水平变化与AS疾病活动度显著相关，检测淋巴细胞亚群可能对AS疾病活动性、治疗效果具有一定的监测和评估作用。

本研究还发现，AS患者外周血中炎性活动指标ESR、Hs-CRP明显高于正常对照组，这与Yavuz等[11]报道结果一致。在相关性分析中发现，AS患者外周血CD3+CD4+细胞百分比与ESR呈正相关，CD3+CD8+细胞百分比及绝对计数与ESR呈负相关，CD3+CD4+、CD3-CD19+细胞百分比与Hs-CRP呈正相关，而CD3+、CD3+CD8+细胞绝对计数与Hs-CRP呈负相关，说明淋巴细胞亚群构成比改变与炎性活动指标ESR、Hs-CRP改变密切相关，但考虑到本次研究样本数量较少，需增加病例数来进一步论证和明确。

综上所述，AS患者存在明显的免疫功能异常，以淋巴细胞亚群数量及比例失调为特征，并且淋巴细胞亚群的变化与AS患者病情活动度及炎症程度存在明显的相关性。淋巴细胞亚群的检测，对于了解患者机体的免疫状态、评估病情以及指导治疗具有重要的临床意义。