不同耐旱性甘薯柴根和块根的差异蛋白组分析

汪宝卿 张海燕 解备涛 段文学 张立明

(1 山东省农业科学院作物研究所, 山东 济南 250100；2 山东省农业科学院, 山东 济南 250100)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam]又名甜薯，为旋花科薯蓣属缠绕草质藤本，是世界第七大粮食作物，其不仅含有碳水化合物、糖类等高能量物质，且还含多种营养元素(如钙、铁等)及抗氧化物质[1]。我国是世界上最大的甘薯种植和生产国，目前甘薯主要应用于保健食品、燃料乙醇、淀粉的精深加工等领域[2]。

甘薯茎节上根原基发育而来的不定根首先发育成纤维根和含色素的加厚根(thickening pigmented roots)，加厚根一部分发生木质化停止膨大形成柴根(thick root)，另一部分继续膨大发育形成块根(storage root)[3]。甘薯的产量和品质主要取决于甘薯块根的生长发育[4]。在我国北方地区，甘薯主要种植于丘陵山地和平原旱地，无人工浇水条件，除栽插时浇窝水外，整个生育期水分供应基本依靠自然降雨，水分亏缺直接影响了苗期根系分化和后期块根膨大[5]。因此，开展干旱条件下的甘薯根系的生长发育研究对甘薯耐旱性育种和抗逆栽培具有重要意义。

目前已有关于块根中上调或优先表达的候选基因研究的报道，但大多数基因主要涉及转录因子的调控或块根在形成、加厚过程中的碳水化合物和蛋白代谢[4,6-10]。在正常供水条件下，转录组研究发现块根苯丙烷代谢途径中含有与淀粉生物合成相关的上调基因和与木质素合成相关的下调基因[11]。在干旱胁迫条件下，尤其是在块根形成的早期阶段，脱落酸响应元件结合因子、脱水应答元件结合因子、同源结构域蛋白等与干旱相关基因大量表达[12]。甘薯根系发育过程中，由于不同品种以及根系分化的时间、节位、类型、外界环境条件等的影响，在适宜的时间和部位取样较困难，因此在甘薯根系发育和抗逆基因挖掘方面很难得到理想的结果。

蛋白组学研究中全蛋白组的定性和定量分析可以为候选基因的筛选和发掘提供线索[13]。在正常条件下，过氧化氢酶(catalase, CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)、过氧化物酶(peroxidase, POD)等会影响甘薯根系分化[3,14]。康乐等[15]研究发现在干旱胁迫条件下，转Cu/ZnSOD和APX基因的甘薯具有较强耐旱性。大量研究表明干旱主要影响甘薯苗期根系细胞质中抗氧化、木质化、能量代谢等相关蛋白活性[16]。目前对甘薯的研究主要集中于甘薯苗期(栽后20 d内)的根系分化，而苗期分化的块根、柴根和纤维根在形态上难以区分，且关于不同耐旱性甘薯柴根和块根中差异蛋白表达研究尚鲜见报道。

本研究在前期双向电泳和iTRAQ试验结果[17]的基础上，对不同耐旱性甘薯不同类型根系间全蛋白组差异蛋白进行精确定量和定性分析，以期揭示干旱条件下不同耐旱性甘薯不同类型根系尤其是柴根和块根在发育过程中的差异蛋白，从蛋白水平揭示不同耐旱性甘薯柴根和块根形成的生理差异，为甘薯耐旱育种和抗逆高产栽培提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取前期已经筛选得到的干旱敏感型甘薯品种济紫薯1(JZS1)和耐旱型甘薯品种济薯21(JS21)[18]，由山东省农业科学院作物研究所提供。

试验在山东省农业科学院作物研究所遮雨棚中进行，小区面积6 m2，株距26 cm，垄距65 cm，垄高35 cm，每小区栽种60株。试验中每个品种均设正常处理(normal，N)和干旱处理(drought,D)，正常处理保持土壤相对含水量在70%以上，干旱处理待土壤相对含水量降至40%左右(中度干旱)保持至收获。土壤水分采用HH2土壤水分测定仪(Delta-T，UK)测定，探针从薯茎处垂直入土10 cm，每垄测定3个点，每2天测定1次，计算补水体积，保证小区水分维持在各处理要求土壤含水量范围内。试验采用完全随机设计，每处理设3次生物学重复。薯苗栽插前模拟降水，水量控制在200 mm，所有处理均浇窝水400 mL，栽插后10 d进行干旱处理，整个试验期(6-8月)内遇到雨水时抗旱棚必须遮雨。2017年6月7日，在山东省农业科学院作物所甘薯室育苗圃挑拣长势一致、无病虫害的薯苗(长约20 cm，有4个完全展开叶)，采用斜插法分别将2个品种薯苗种植于垄中，确保薯苗3个节入土。

本试验分别于栽插后60 d(8月6日)取样，先用剪刀剪去甘薯的地上部分，将整个根系小心挖出，迅速将甘薯根系冲洗干净，用吸水纸吸干根系表面水分，取柴根(thick root, TR)和块根(storage root, SR)中间段1～2 g并用锡箔纸包裹，液氮速冻后，-80℃保存备用。

1.2 测定方法

1.2.1 根系总蛋白质提取 采用酚/SDS抽提法[19-20]提取甘薯根部总蛋白。

1.2.2 蛋白质裂解及定量 参照Bradford[21]的方法进行蛋白质定量分析，并建立了蛋白浓度与OD595关联的回归方程为y=0.881x+0.016 (R2=0.995 )。

1.2.3 蛋白还原烷基化及酶解 参照FASP法[22]酶解蛋白。

1.2.4 蛋白标记及质谱试验 参照汪宝卿等[17]的方法进行iTRAQ标记和质谱分析。

1.2.6 数据库检索和差异蛋白筛选 差异蛋白筛选标准参照秦志英[23]的方法。

1.2.7 差异蛋白生物信息功能分析 根据蛋白质谱搜库检索和差异蛋白筛选结果，进行BLAST比对，同源映射到近缘模式生物，再进行GO和KEGG通路分析。

2 结果与分析

2.1 差异表达蛋白鉴定结果

样品经LC-MS/MS检测、搜库后，筛选得到假发现率(false-discovery rate, FDR)<1%的甘薯根系差异蛋白2 003个。按照Score Sequest HT > 0且peptide≥1的标准，并剔除比值为空白的数据，筛选到可信蛋白 1 716 个，其中在各比较组中均出现显著上调或显著下调的动态表达蛋白有819个。以此为基础，计算得到每一比较组的差异倍数(fold change, FC)和差异显著性P值，筛选各比较组差异表达蛋白(表1～3)。

表1 差异蛋白的肽段数目和分布情况Table 1 The number and distribution of peptides in differential proteins

注：JS21NSR-JS21NTR表示正常条件下JS21的块根与柴根间的差异蛋白，JS21DSR-JS21DTR表示干旱条件下JS21的块根与柴根间的差异蛋白，JZS1NSR-JZS1NTR表示正常条件下JZS1的块根与柴根间的差异蛋白，JZS1DSR-JZS1DTR表示干旱条件下JZS1的块根与柴根间的差异蛋白，JS21NTR-JZS1NTR表示正常条件下JS21与JZS1柴根间的差异蛋白，JS21NSR-JZS1NSR表示正常条件下JS21与JZS1块根间的差异蛋白，JS21DTR-JZS1DTR表示干旱条件下JS21与JZS1柴根间的差异蛋白，JS21DSR-JZS1DSR表示干旱条件下JS21与JZS1块根间的差异蛋白。下同。
Note：JS21NSR-JS21NTR represents differential proteins between SR and TR of JS21 under normal condition, JS21DSR-JS21DTR represents differential proteins between SR and TR of JS21 under drought stress, JZS1NSR-JZS1NTR represents differential proteins between SR and TR of JZS1 under normal condition, JZS1DSR-JZS1DTR represents differential proteins between SR and TR of JZS1 under drought stress, JS21NTR-JZS1NTR represents differential proteins of TR between JS21 and JZS1 under normal condition, JS21NSR-JZS1NSR represents differential proteins of SR between JS21 and JZS1 under normal condition, JS21DTR-JZS1DTR represents differential proteins of TR between JS21 and JZS1 under drought stress, JS21DSR-JZS1DSR represents differential proteins of SR between JS21 and JZS1 under drought stress. The same as following.

2.2 不同耐旱性甘薯根系差异蛋白生物信息功能分析

GO分析表明，正常供水条件下，JS21的块根与柴根相比，差异蛋白主要集中在金属离子反应、降解代谢等生物过程(biological process)，涉及细胞质和细胞质部分等细胞组分(cell component)，从水解酶活性、氧化还原酶活性、葡萄糖苷酶等方面体现蛋白分子功能(molecular function)。JZS1的块根与柴根相比，其差异蛋白参与的生物过程与JS21一致，主要涉及细胞溶质、细胞质部分等细胞组分，从氧化还原酶活性、铜离子结合和抗氧化活性等方面体现蛋白分子功能。JS21柴根与JZS1柴根相比，差异蛋白主要集中于核苷代谢、小分子代谢、碳水化合物代谢等生物过程，涉及细胞质部分、细胞质和细胞溶质等细胞组分，从铜离子结合、甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性、氧化还原酶活性等方面体现蛋白分子功能。JS21块根与JZS1块根相比，差异蛋白主要集中于无机物底物反应、小分子代谢、金属离子反应等生物过程，涉及细胞质、细胞质部分和细胞溶质等细胞组分，从核糖体结构组分、结构分子活性、mRNA结合等方面体现蛋白分子功能。与柴根相比，JS21和JZS1块根的表达蛋白主要在蛋白分子功能方面差异较大；品种间比较发现，柴根、块根的表达蛋白在生物过程和蛋白分子功能方面差异较大。

表2 差异蛋白的分子量分布Table 2 The distribution of molecular weight in differential proteins /个

表3 各比较组中差异蛋白数Table 3 The number of differential proteins in comparing intergroup /个

干旱胁迫处理下，JS21的块根与柴根相比，差异蛋白主要集中于单糖生物合成、刺激反应、糖异生、己糖合成、单有机物合成和单有机物降解等生物过程，涉及细胞溶质、细胞质和细胞质部分等细胞组分，从金属离子结合、阳离子结合等方面体现蛋白分子功能。JZS1的块根与柴根相比，差异蛋白主要集中在碳水化合物代谢、有机物合成、ATP代谢、葡萄糖代谢等生物过程，涉及细胞溶质、细胞质部分和细胞质等细胞组分，从蔗糖合酶活性、ATPase活性、氢离子跨膜转运蛋白活性和结构分子活性等方面体现蛋白分子功能。JS21柴根与JZS1柴根相比，差异蛋白主要集中在单有机物代谢、小分子代谢、碳水化合物代谢等生物过程，涉及细胞溶质、细胞质部分、细胞质和液泡等细胞组分，从钴离子结合、有机酸结合、羧酸结合等方面体现蛋白分子功能。JS21块根与JZS1块根相比，差异蛋白主要集中在单有机物代谢、小分子代谢、无机底物反应、刺激反应等生物过程，涉及细胞溶质、细胞质部分、细胞质和质外体等细胞组分，从铜离子结合、结构分子活性、过氧化物酶活性、氧化还原酶活性等方面体现蛋白分子功能。与柴根相比，JS21块根中差异蛋白主要与糖合成代谢等生物过程有关，而JZS1块根中的差异蛋白主要与能量代谢等生物过程有关；与JZS1相比，JS21块根中差异蛋白的分子功能主要体现在的抗氧化能力和结构分子活性维持方面。

KEGG分析发现，正常供水条件下，与柴根相比，JS21块根差异表达蛋白主要富集在次生代谢合成、剪接体、苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代谢、碳代谢等代谢通路，JZS1的块根差异表达蛋白主要富集在次生代谢合成、碳代谢、核糖体、苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖合成、氨基酸合成、丙酮酸代谢等代谢通路。与JZS1柴根相比，JS21柴根差异蛋白主要集中次生代谢合成、碳代谢、淀粉和蔗糖合成、氨基酸合成等代谢通路；与JZS1块根相比，JS21块根差异蛋白主要集中次生代谢合成、核糖体、淀粉和蔗糖代谢、碳代谢、内质网蛋白加工、糖酵解、氧化磷酸化等代谢途径。与柴根相比，2个品种块根的差异蛋白均富集在次生代谢、碳代谢、苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代谢等通路；与JZS1相比，JS21的柴根、块根差异蛋白富集的代谢通路均富集在次生代谢、淀粉和蔗糖代谢、碳代谢等通路。

在干旱处理情况下，与柴根相比，JS21块根差异蛋白主要集中次生代谢合成、内质网蛋白加工、丙酮酸代谢等代谢通路，JZS1的块根差异表达蛋白主要富集在次生代谢合成、碳代谢、核糖体、淀粉和糖代谢、苯丙烷生物合成、氨基酸生物合成等代谢通路。与JZS1柴根相比，JS21柴根差异蛋白主要富集在次生代谢合成、核糖体、氧化磷酸化、谷胱甘肽代谢、类黄酮合成等代谢通路；与JZS1块根相比，JS21块根差异蛋白主要集富集在次生代谢合成、碳代谢、核糖体、内质网蛋白加工等代谢通路。在干旱胁迫条件下，同一品种的块根与柴根之间、不同品种的块根或柴根之间差异蛋白富集的代谢通路变化较大。

2.3 不同耐旱性甘薯根系差异蛋白表达模式分析

基于KEGG通路分析和之前的研究结果[16-17]，选取淀粉和蔗糖代谢与苯丙烷生物合成2个代谢通路进一步细化，明确正常和干旱条件下不同类型甘薯根系的差异蛋白。

由表4可知，正常供水条件下，与JZS1的柴根相比，JS21柴根的淀粉和蔗糖代谢相关酶除UGP1外均上调表达；苯丙烷代谢的PER上调表达，但木质素合成相关的CAD、CCOAOMT1和抗氧化相关的CSD、CAT等均下调表达。与JZS1的块根相比，JS21块根的淀粉和蔗糖代谢相关酶除UGP1外均上调表达，苯丙烷代谢的PER52、PER53、CAD1和BGLU17均上调表达，而PER21下调表达。

比较正常供水条件下品种内不同类型根发现，与柴根相比，JS21和JZS1块根中参与淀粉和蔗糖代谢的酶如SBE2.1、APS1、APL3均上调表达，而SUS6和BGLU17均下调表达，上调表达的UGP1和SS1仅参与了JZS1块根的淀粉和蔗糖代谢。2个品种中块根参与苯丙烷代谢中的酶如PER52、PER72、CAD6和BGLU17均下调表达，JS21块根中无上调表达蛋白，JZS1块根中仅PER21上调表达。

在干旱条件下比较品种间发现，与JZS1的柴根相比，JS21柴根淀粉和蔗糖代谢的SUS3、TPS5、AMY1、PHS2上调表达，SPS1、UGP1下调表达；苯丙烷代谢中无上调蛋白，PER17、PER52、OMT1下调表达。与JZS1的块根相比，JS21块根淀粉和蔗糖代谢中PHS1、APS1、APL3上调表达，SUS4、SUS6下调表达；苯丙烷代谢中的PER21上调表达，而抗氧化相关的PER52、PER72和木质素合成关键酶4CL2、CAD9均下调表达。

比较干旱条件下品种内不同各类型根发现，与柴根相比，JS21块根2个通路中上调表达的仅有APL3和PER21，干旱影响了块根中SBE2.1、PHS2、APS1的表达；JZS1块根2个通路中上调表达的有SBE2.1、SUS3、SUS4、SUS6、AMY1和CAD1，且鉴定出的蔗糖合酶数量最多，干旱引起了其块根中木质素合成增加。2个品种中柴根的PER均上调表达，且JS21柴根中的PER数量多于JZS1，但CSD仅JZS1中上调表达。

3 讨论

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase, ADPGase)可催化合成ADP-葡萄糖，是淀粉合成过程中的第1个限速酶[24]。UTP-葡萄糖-1-磷酸化尿苷酰基转移酶(UTP-glucose -1-phosphate uridylyltransferase)又称尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase, UDPGase)，可催化合成UDP-葡萄糖作为参与蔗糖、纤维素、果胶质等代谢的葡萄糖供体，此外与胞液中的AGPGase相偶联形成ADPG，参与造粉体淀粉的合成[25]。本研究发现，在正常条件下，与JS21相比，JZS1块根和柴根中的UGP1均上调表达；与JZS1柴根相比，其块根中的APL3、APS1和UDPGase均上调表达，而JS21块根中仅有APL3、APS1上调表达，表明JS21和JZS1间存在不同的淀粉积累模式。而在干旱胁迫条件下，JS21块根中的APL3仍上调，AMY1下调，JZS1块根中的SUS3、SUS4、SUS6和AMY1上调，SPS1下调。说明在干旱胁迫条件下，耐旱性强的JS21块根中淀粉的合成仍大于淀粉的分解，而耐旱性弱的JZS1块根中的蔗糖分解大于蔗糖的合成，与前人研究一致[26]。

甘薯的柴根是由加厚的色素根中柱木质化后形成[27]，有研究认为甘薯柴根是徒耗养分的根[28]。本研究发现，在正常条件下，JS21的柴根中主要含有多种过氧化物酶，如PER52、PER55和PER72，JZS1的柴根中不仅有过氧化物酶PER17、过氧化氢酶CAT2还有超氧化歧化酶CSD1和CSD2；在干旱胁迫条件下，2个品种柴根的抗氧化酶主要为过氧化物酶类，说明柴根中含有丰富的抗氧化酶，柴根的这种保护作用，可能是甘薯在进化过程中适应环境的一个重要表现。这与关于不同耐旱性甘薯不同类型根系抗氧化特性分析的结论一致[29]。但抗氧化酶在块根中的表达模式与柴根中存在差异。在正常条件下，与JZS1相比，JS21的块根中PER21下调、PER52和PER53上调；在干旱胁迫条件下，JS21的块根中PER21上调、PER52和PER72下调，说明干旱诱导了JS21块根中的PER21过量表达，PER21可能是耐旱性强的甘薯块根抵御逆境胁迫的重要手段，PER21和PER52的变化可作为筛选耐旱性甘薯的重要指标；干旱条件下耐旱性弱的JZS1块根中PER21、PER52和CSD2均下调表达，且均低于柴根中的抗氧化酶表达量，只有CAD1表达上调，说明干旱条件下JZS1抵御干旱胁迫的能力差，块根中木质化水平高。有研究表明将铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase, Cu/Zn SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)基因转入甘薯，能提高其耐旱性[30]。本研究进一步明确了耐旱性强的甘薯品种可通过诱导块根中的抗氧化酶含量增加，并与柴根中的抗氧化酶协同抵御干旱胁迫，而耐旱性弱的甘薯柴根和块根的抗氧化能力差，块根木质化程度加剧。

表4 各比较组中主要通路中差异蛋白信息Table 4 The details of differential proteins in main pathway of comparing intergroup

表4(续)

表4(续)

表4(续)

表4(续)

CAD是木质素合成的关键酶，CAD基因能被活性氧诱导上调表达，在干旱胁迫条件下可通过提高木质素含量来维持细胞正常的渗透压，抵御逆境胁迫[27]。本研究结果表明，干旱胁迫条件下，耐旱性弱的JZS1块根与柴根相比，其CAD1上调表达，耐旱性强的JS21块根中则没有木质素合成相关的酶表达。品种间比较发现，干旱胁迫条件下耐旱性弱的JZS1的块根中4CL2、CAD9均上调表达，耐旱性强的JS21块根则下调表达。说明干旱导致了耐旱性弱的甘薯品种块根木质化程度加剧，与之间的结论一致[17]。

最新的研究发现，通过转甘薯肉桂酸-4-羟基化酶(cinnamate 4hydroxylase,C4H)基因可提高烟草的耐旱性[31]。C4H与CAD、4-香豆酸-辅酶连接酶(4-coumarate-CoA ligase,4CL)、咖啡酰莽草酸酯酶(caffeoyl shikimate esterase, CSE)均为木质素单体生物合成的关键酶[32]。本研究发现，上述酶仅在正常条件下木质化程度高的柴根和干旱条件下耐旱性弱的甘薯块根中出现。表明木质素在正常条件下甘薯柴根发育过程中起到重要的调控作用，木质素合成相关酶的上调表达并不能增强干旱胁迫条件下甘薯的耐旱性，只是耐旱性弱的甘薯对干旱胁迫的一种生理响应。

前期研究发现，耐旱性弱的JZS1苗期根系中主要是能量代谢相关蛋白[17]。本研究结果表明，正常条件下，JZS1的块根中SPS1上调、SUS6下调，在干旱条件下其块根中的SUS3、SUS4、SUS6上调、SPS1下调。蔗糖磷酸合酶(sucrose-phosphate synthase, SPS)能利用UDPG为底物合成蔗糖[33]，而蔗糖合酶(sucrose synthase, SUS)能催化蔗糖的合成与分解[34]。本研究发现，SPS和SUS在正常和干旱胁迫条件下的作用相反。在正常条件下，SUS是甘薯块根发育过程中最活跃的酶，表达模式与ADPGase类似，能促进淀粉积累，但在干旱胁迫条件下，在耐旱性弱的甘薯遭受干旱胁迫且能量供给有限的情况下，SUS可发挥在催化蔗糖合成或分解的过程中几乎不消耗能量的特性，为甘薯糖酵解过程快速提供还原糖，从而参与植株的逆境响应过程，缓解逆境胁迫造成的危害[35]。虽然SUS是催化蔗糖合成或分解的可逆酶，但也暗示蔗糖合酶在甘薯抵御干旱胁迫过程中可能更倾向于分解功能。

4 结论

本研究通过对不同耐旱性甘薯柴根和块根的差异蛋白进行分析，共鉴定得到差异蛋白2 003个。干旱胁迫处理下，与柴根相比，JS21和JZS1块根差异蛋白分别集中于细胞质内碳水化合物合成、能量代谢等生物过程；与JZS1块根相比，JS21块根差异蛋白分子功能主要涉及过氧化物酶活性、氧化还原酶活性等。在干旱胁迫条件下，耐旱性强的JS21块根中淀粉的合成仍大于分解，而耐旱性弱的JZS1块根中的蔗糖分解大于合成。正常条件下，2个品种柴根中均含有丰富的抗氧化酶；干旱诱导了JS21块根产生过氧化物酶，而JZS1块根中木质素合成关键酶则上调表达。本研究重新审视了柴根在甘薯根系生长发育和抵抗逆境中的作用，初步明确了耐旱性甘薯不同类型根系协同抵御干旱胁迫的生理机制。本试验通过大量的全蛋白组生物信息学分析，发现了一些甘薯柴根与块根间、耐旱性强和耐旱性弱的甘薯品种间可能的差异蛋白，对探寻甘薯根系发育和耐旱性差异有一定的指导意义。但鉴定到的差异蛋白主要是代谢通路下游的功能蛋白，对代谢通路上游的调控因子的相关信息仍不明确。下一步将继续围绕耐旱性甘薯品种差异，开展代谢组研究，通过比对蛋白组和代谢组的差异蛋白或基因，为深入挖掘甘薯淀粉调控和耐旱基因提供一定的理论支撑。