雷帕霉素对动脉粥样硬化小鼠的治疗作用及机理①

王 平 姚平波 张剑锋

(南华大学附属南华医院重症医学科，衡阳421002)

动脉粥样硬化是临床常见的心脑血管疾病如冠心病、脑梗死和外周血管病变的主要病理原因，其发病的本质是脂质代谢障碍，特点表现为受累动脉病变从内膜开始，一般先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，进而纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄，且动脉血管内膜积聚大量黄色粥样脂质[1,2]。动脉粥样硬化的发病原因较为复杂，与高血压、高血脂、糖尿病、肥胖和遗传因素等均有密切关系[3,4]。自噬是真核细胞保守的生物学现象，在维持细胞脂质稳态中发挥着重要作用[5]。自噬在粥样硬化中扮演双刃剑的角色，起初的研究显示在动脉粥样硬化过程中自噬水平明显增加，促进了动脉粥样硬化的进展[6,7]。但是最近有报道显示自噬也可以缓解动脉粥样硬化的发生[8,9]。但是机制尚不完全清楚。本研究采用自噬激活剂雷帕霉素分析了其对动脉粥样硬化的影响，旨在为临床治疗动脉粥样硬化提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 8周龄载脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-) C57BL/6J小鼠购自北京维通利华公司；DMEM培养基、胎牛血清和青链霉素均购自美国Gibico公司；LC3兔多克隆抗体均购自日本MBL公司;BODIPY493/503购自美国Thermo Fisher公司；TNF-α、IL-6和IL-1β ELISA试剂盒购自美国R&D公司；Ⅱ型胶原酶购自美国Sigma公司；高脂饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司；JEM-ARM200F 透射电子显微镜购自日本电子；ZEISS510激光共聚焦显微镜购自德国蔡司公司。

1.2方法

1.2.1动脉粥样硬化模型构建、分组和治疗 30只6周龄ApoE-/-C57BL/6J小鼠随机分为两组，模型组和实验组。同时选取15只正常小鼠作为对照组。模型组和实验组小鼠(每组15只)均从第6周开始采用高脂饲料喂养，两组小鼠均喂养6周，至第12周实验组小鼠经尾静脉注射雷帕霉素10 mg/kg，对照组和模型组经尾静脉注射等体积的生理盐水。连续治疗1周后处死小鼠进行后续实验。

1.2.2主动脉平滑肌细胞分离和培养 对照组、模型组和实验组小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡3 min，无菌条件下打开胸腔，剪取沿主动脉弓及下端至膈的主动脉，置于无菌磷酸盐缓冲液中，用镊子剥离血管外组织和脂肪，将血管转移至新鲜细胞培养皿中，将血管剪碎，加入1.5 mg/ml的 Ⅱ 型胶原酶在37℃酶解30 min，然后将细胞采用80目细胞筛过滤，将细胞均匀铺于6孔板或者爬片上，然后进行后续实验。

1.2.3HE染色分析主动脉病理变化 对照组、模型组和实验组小鼠处死后，取心脏主动脉，用石蜡包埋，并切成8 μm的切片，将切片在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中分别处理15 min使组织透明，甩掉二甲苯，切片依次置于无水乙醇Ⅰ 5 min，无水乙醇Ⅱ 5 min，95%酒精5 min，90%酒精5 min，80%酒精5 min，70%酒精5 min，然后将切片浸于蒸馏水中5 min，然后采用苏木精染色15 min，用水冲洗干净后，用1%盐酸酒精分化，再用自来水冲洗15 min，然后1%氨水酒精迅速处理5 s，用自来水洗涤，然后采用1%伊红染色3 min，自来水洗涤后再进行脱水、中性树脂封片处理。然后在显微镜下观察病理变化。

1.2.4免疫荧光分析主动脉平滑肌细胞自噬水平 待对照组、模型组和实验组平滑肌细胞爬片贴壁后，将细胞采用4%多聚甲醛固定10 min，然后用PBS洗涤3次后，采用5%的BSA封闭液室温封闭30 min，然后采用封闭液稀释羊抗兔LC3抗体(1∶200),在4℃孵育过夜，次日用PBS洗涤3次，每次5 min，然后采用FITC标记的羊抗兔荧光二抗在室温孵育2 h，结束后用PBS洗涤3次，每次5 min，用DAPI染核，封片后采用激光共聚焦显微镜观察自噬膜泡的数量。

1.2.5BODIPY染色分析平滑肌细胞脂质水平 对照组、模型组和实验组平滑肌细胞爬片贴壁后，将细胞采用4%多聚甲醛固定10 min，然后用PBS洗涤3次后，然后采用BODIPY493/503染料(1∶2 000)在室温染色20 min，PBS洗涤3次，每次5 min，然后采用DAPI染核，最后滴加防淬灭剂，封片，采用激光共聚焦显微镜观察细胞中脂质水平。

1.2.6ELISA分析炎症因子水平 对于小鼠血清，三组小鼠处死前眼球取血，然后分离血清；对于平滑肌细胞，对照组和实验组平滑肌细胞分别培养于6孔板中，细胞连续培养12 h后，收集细胞上清。采用ELISA试剂盒测定对照组和实验组小鼠血清或平滑肌细胞上清中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。

2 结果

2.1三组小鼠主动脉病理变化 与对照组小鼠比较，模型组小鼠组主动脉血管内膜增厚，血管壁厚薄不均一，可见泡沫样细胞及胆固醇结晶形成的粥样斑块病灶；实验组小鼠主动脉血管泡沫化程度缓解，动脉粥样硬化程度减轻。实验组小鼠主动脉壁红色脂肪性板块数量较模型组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2三组小鼠平滑肌细胞自噬分析 实验采用免疫荧光染色自噬体标记物LC3分析了雷帕霉素处理后细胞自噬体数量的变化，结果如图2所示，可见对照组平滑肌细胞有较少的自噬体，而实验组小鼠主动脉平滑肌细胞自噬体数量很多。定量分析显示，对照组和模型组小鼠主动脉平滑肌细胞LC3标记的自噬体数量(11.86±3.97)个，(9.43±3.02)个明显低于实验组小鼠主动脉平滑肌细胞(23.87±6.03)个，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 三组小鼠主动脉病理变化分析(×100)Fig.1 Pathological changes of aorta in three groups of mice(×100)

图2 三组小鼠主动脉平滑肌细胞自噬体比较Fig.2 Comparison of autophagosome number of aortic smooth muscle cells in three groups

2.3三组小鼠平滑肌细胞脂质水平分析 结果如图3所示，采用免疫荧光对主动脉平滑肌细胞中脂质染色显示，可见与对照组比较，模型组细胞中大量脂质被染色，且呈聚集状态，而经雷帕霉素处理的实验组小鼠主动脉平滑肌细胞中脂质相对较少。定量分析显示模型组脂质荧光强度(198.43±29.54)明显高于对照组和实验组脂质荧光强度(121.43±17.91)(89.43±12.49)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4三组小鼠血脂水平比较 结果如表1所示，与对照组比较，模型组小鼠TC、TG、LDL和HDL水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，实验组小鼠TC、TG、LDL和HDL水平均显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组和实验组小鼠外周血TC、TG、LDL和HDL水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5三组小鼠炎症因子水平分析 实验采用ELISA分析对照组和实验组小鼠外周血和主动脉平滑肌细胞培养上清中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，结果如表2所示，与模型组比较，实验组小鼠外周血和主动脉平滑肌细胞培养上清中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平均显著下调，差异有统计学意义(P<0.06)。对照组和实验组小鼠外周血和主动脉平滑肌细胞培养上清中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平比较差异无统计学意义(P<0.05)。

图3 三组小鼠主动脉平滑肌细胞脂质水平比较Fig.3 Comparison of lipid level of aortic smooth muscle cells in control group and experiment group

GroupsnTC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL(mmol/L)HDL(mmol/L)Control group 1521.27±4.091.32±0.383.12±1.453.02±0.15Model group1554.11±5.091)2.09±0.111)18.28±3.511)4.19±0.281)Experiment group1525.87±4.151.45±0.274.91±1.263.75±0.18

Note：1)P<0.05 vs the control group and experiment group.

GroupsnThe peripheral blood(pg/ml)TNF-αIL-6IL-1βThe culture supernatant of aortic smooth muscle cells(pg/ml)TNF-αIL-6IL-1βControl group 15171.54±20.44519.19±43.12291.58±25.2926.19±6.3840.22±7.0169.44±10.12Model group15312.44±25.321)943.32±40.321)732.12±23.561)56.44±7.091)98.48±9.011)173.23±12.541)Experiment group15198.43±19.87559.19±32.43309.15±19.6430.61±5.8947.24±6.9478.99±7.42

Note：1)P<0.05 vs the control group and experiment group.

3 讨论

自噬是来源于内质网的无核糖体附着区的双层膜，包裹部分胞质和细胞内需要降解的细胞器、蛋白质、受损伤的细胞结构等形成自噬体，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新的生物学过程。目前研究显示自噬在许多人类疾病中发挥着重要作用，包括神经退行性疾病、肿瘤和衰老等[10,11]。研究也发现自噬在动脉粥样硬化过程中起着重要作用[6]。研究发现离体的血管平滑肌细胞、巨噬细胞和内皮细胞受到外界刺激后，会促进动脉粥样硬化的发生，而在这个过程中，细胞中会出现泛素化和包涵体聚集等不同程度的自噬现象[12]。此外，在动脉粥样硬化的中晚期阶段，平滑肌细胞的自噬过程将会加速纤维帽变薄，从而促使斑块向不稳定方向发展[13]。但是随着研究的不断深入，自噬可能在预防动脉粥样硬化发生过程中发挥正面角色。动脉脂质积累和泡沫化细胞形成是动脉粥样硬化的关键，通过促进自噬可以显著清除细胞内脂质水平，进而达到缓解动脉粥样硬化的目的。

本研究首先发现注射雷帕霉素后从病理角度而言，其可以显著缓解动脉粥样硬化的程度，表现为动脉血管周围脂质减少、泡沫化细胞减少，血管内膜相对完整，说明促进自噬的确对动脉粥样硬化有治疗效果。本研究从主动脉平滑肌细胞着手，研究发现雷帕霉素可以显著提高主动脉平滑肌细胞的自噬水平，表现为细胞自噬膜泡。同时我们发现雷帕霉素处理后血管平滑肌细胞内脂质水平明显减少。而目前已经有研究发现ox-LDL诱导脐静脉内皮细胞，被吸收后的ox-LDL可通过自噬-溶酶体途径降解。本研究结果再次证明促进自噬可促进主动脉平滑肌细胞将胞内大量的脂质降解。血管平滑肌细胞在动脉粥样硬化小鼠中会处于慢性炎症状态，进而释放炎症因子，加剧动脉粥样硬化的发生。我们的研究发现雷帕霉素处理后无论小鼠外周血还是平滑肌细胞培养上清中炎症因子的水平均显著下调，说明雷帕霉素诱导细胞自噬后炎症水平得到了显著抑制。而炎症因子水平降低，对缓解动脉粥样硬化具有重要意义。

综上所述，雷帕霉素可显著促进细胞自噬，促进主动脉平滑肌细胞加速脂质代谢，进而降低主动脉平滑肌细胞炎症水平，缓解了动脉粥样硬化疾病的进展。