芦荟素抑制p65的磷酸化对大鼠脑缺血再灌注诱导的组织损伤和炎症的调节作用①

赵 杨 孙 波 杜书章

(郑州大学第五附属医院药学部，郑州450000)

脑缺血再灌注(CIRI)是脑组织血流供应突然中断后再灌注，可引起严重的神经功能障碍，在临床上给患者及家人的生活带来了严重的危害[1]。已有研究表明，CIRI早期诱发的炎症反应是造成脑组织继发性损伤的重要原因，会激活机体一系列的病理级联反应[2]。因此，有效控制机体炎症反应是保护脑组织不受损伤的关键。芦荟是我国传统中药，已有2000多年的药用历史，其常用的药用成分包括芦荟素、芦荟苷、芦荟多糖、芦荟大黄素等，具有抗氧化、抗炎、调节机体免疫功能等多种药理作用[3]。芦荟素(Aloin)是芦荟的主要成分，具有抗菌、抗炎、抗癌、抗衰老等作用[4]。近年来已有研究者证实，Aloin具有很好的抗炎效用，可以调节多种炎症因子的表达，但临床上对Aloin在CIRI中的应用尚未见报道[5]。因此，本研究建立了大鼠缺血再灌注模型，旨在分析Aloin保护大鼠CIRI损伤的具体作用机制，为临床应用提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1仪器、试剂与动物 SPF级SD雄性大鼠64只，体重250～280 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK(京)2017-0022，饲养于本院动物中心实验室，保持室温恒定为25℃，模拟昼夜每12 h更换一次光照条件，动物自由摄食与饮水。芦荟素购自中国药品制品生物检定所，批号0852-9902；白介素(IL)-6和IL-10酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；细胞黏附分子-1(ICAM-1)抗体购自北京中山生物技术有限公司；兔抗人p-NF-κB p65、NF-κB p65、肿瘤坏死因子(TNF-)α、Caspase-3和Caspase-9单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG，购于DAKO公司。

1.2方法

1.2.1动物造模及给药 大鼠预饲养1周后，将64只SD大鼠随机分为对照组、Aloin组、MCAO组和Aloin+MCAO组各16只。MCAO组和Aloin-MCAO组大鼠采用Longa法制备动物脑中动脉缺血再灌注(MCAO)模型[6]，以6 ml/kg 5%水合氯醛腹腔内注射麻醉，于颈部行纵行切口，用长6 cm、直径0.26 mm尼龙线于近心端结扎脑中动脉，并缝合，缺血2 h后拔出栓线实现再灌注；对照组和Aloin组仅暴露脑中动脉，插入栓线约10 mm，不进行结扎。若术后24 h内，MCAO组和Aloin-MCAO组出现神经缺损症状，则为造模成功[6]。造模成功后，Aloin组和Aloin-MCAO组腹腔注射Aloin 50 mg/kg，连续7 d；MCAO组和对照组腹腔注射等量生理盐水。于治疗后处死大鼠，迅速断头取脑，无菌取脑皮层及海马组织。

1.2.2各组大鼠存活率和神经病学评分 检测10 d 内大鼠存活率，参照Zea Longa 5分制标准[7]对各组大鼠进行神经病学评分。

1.2.3HE染色和TUNEL法检测各组大鼠脑组织损伤 处死大鼠，取大鼠脑组织，采用4%多聚甲醛固定，进行常规脱水、透明、包埋和切片。一份切片进行HE染色，在光镜下观察组织的病理变化，每张切片随机取5个视野拍照。另一份切片严格按照TUNEL试剂盒说明操作染色，置于荧光显微镜下观察，采用ImageJ对图像进行分析处理，每张图像随机选取10个视野用以计算阳性细胞数与总细胞数，计算细胞凋亡率，细胞凋亡率=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.4Western blot检测NF-κB p65信号通路相关蛋白的表达 取对数生长期神经元细胞，使用细胞裂解液严格按照蛋白裂解步骤提取总蛋白，Lowry法蛋白定量，依次SDS-PAGE凝胶电泳，电转膜至PVDF膜、室温密封2 h，洗膜并加一抗4℃孵育过夜，洗膜加二抗室温孵育2 h。再用ECL化学发光显示，收集影像，通过积分吸光度(Integrated absorbance,IA)值分析对比条带强弱，选用β-actin作为内参，采用半定量分析。

1.2.5脑组织中相关因子的测定 取之前制作的切片，进行免疫组化染色，检测脑组织ICAM-1的表达量。取脑组织，匀浆，离心(3 500 r/min，10 min)，取上清，用ELISA法测定IL-6、IL-10的表达水平，严格按试剂盒说明书进行测定。

2 结果

2.1Aloin对CIRI大鼠神经功能和存活率的影响 与对照组相比，Aloin组大鼠存活率和神经功能缺损评分均无显著差异(P>0.05)，MCAO组大鼠存活率显著下降(P<0.05)，神经功能缺损评分显著升高(P<0.05)；与MCAO组相比，Aloin-MCAO组大鼠存活率显著升高(P<0.05)，神经功能缺损评分显著下降(P<0.05)，见图1。

2.2Aloin对CIRI大鼠脑组织损伤和凋亡的影响 HE染色结果显示，对照组和Aloin组大鼠脑组织未见明显病理变化，脑组织细胞结构完整，未见炎性细胞浸润；MCAO组大鼠脑组织缺血区皮质出现水肿，胞间隙变宽，结构较疏松，空泡样改变明显，细胞核固缩深染，核仁消失，伴随大量炎性细胞浸润；Aloin-MCAO组大鼠脑缺血区皮质病理损伤减轻，间质水肿程度减轻，细胞排列较整齐，缺血区变性和坏死的神经元数量明显减少。TUNEL染色显示，与对照组相比，Aloin组大鼠脑组织细胞凋亡率无显著差异(P>0.05)，MCAO组大鼠脑组织细胞凋亡率显著升高(P<0.01)；与MCAO组相比，Aloin-MCAO组脑组织细胞凋亡率显著下降(P<0.01)，见图2。

图1 各组大鼠的存活率和神经功能评分Fig.1 Survival rate and neurological function score in each groupNote: Compared with control group，*.P<0.05;compared with MCAO group，#.P<0.05.

2.3Aloin对CIRI大鼠脑组织凋亡标记分子Caspase-3和Caspase-9表达的影响 与对照组相比，Aloin组大鼠脑组织Caspase-3和Caspase-9的表达无显著差异(P>0.05)，MCAO组大鼠脑组织Caspase-3和Caspase-9的表达显著上调(P<0.01)；与MCAO组相比，Aloin-MCAO组脑组织Caspase-3和Caspase-9的表达显著下调(P<0.01)，见图3。

2.4Aloin对CIRI大鼠脑组织ICAM-1、IL-6和IL-10表达的影响 与对照组相比，Aloin组大鼠脑组织ICAM-1、IL-6和IL-10的表达无显著差异(P>0.05)，MCAO组大鼠脑组织ICAM-1和IL-6的表达显著升高(P<0.01)，IL-10的表达无显著差异(P>0.05)；与MCAO组相比，Aloin-MCAO组脑组织ICAM-1和IL-6的表达显著下降(P<0.01)，IL-10的表达显著升高(P<0.01)，见图4。

2.5Aloin对CIRI大鼠脑组织NF-κBp65磷酸化及下游靶基因TNF-α表达的影响 与对照组相比，Aloin组大鼠脑组织p-NF-κBp65/NF-κBp65和TNF-α的表达无显著差异(P>0.05)，MCAO组大鼠脑组织p-NF-κBp65/NF-κBp65和TNF-α的表达显著上调(P<0.01)；与MCAO组相比，Aloin-MCAO组脑组织p-NF-κBp65/NF-κBp65和TNF-α的表达显著下调(P<0.01)，见图5。

图2 各组大鼠脑组织损伤和凋亡

Fig.2 Brain tissue damage and apoptosis in each group

Note: Compared with control group，**.P<0.01；compared with MCAO group，##.P<0.01.

图3 各组大鼠脑组织凋亡标记分子Caspase-3和Caspase-9的表达Fig.3 Expression of apoptosis marker molecules Caspase-3 and Caspase-9 in brain tissues in each groupNote: Compared with control group，**.P<0.01；compared with MCAO group，##.P<0.01.

图4 各组大鼠脑组织ICAM-1、IL-6和IL-10的表达

Fig.4 Expression of ICAM-1,IL-6 and IL-10 in brain tissues in each group

Note: Compared with control group，**.P<0.01；compared with MCAO group，##.P<0.01.

图5 各组大鼠神经元细胞JNK/p38 MAPK信号及其下游凋亡相关蛋白的表达Fig.5 Expression of JNK/p38 MAPK signal and its downstream apoptosis-related proteins in rat neuronal cellsNote: Compared with control group，**.P<0.01；compared with MCAO group，##.P<0.01.

3 讨论

CIRI主要是由于脑缺血一定时间血液再灌注后，导致的结构损伤和功能障碍[8]。已有多项研究表明，炎症反应是CIRI损伤的主要病理机制之一，会引起一系列病理反应[9,10]。Aloin是芦荟的主要活性成分，现代药理学研究表明，其具有抗肿瘤、抗菌、抗炎等药理作用[11]。Chang等[12]的研究表明，芦荟素可以降低氧糖剥夺/复氧引起的过高的氧化应激水平，抑制细胞凋亡，保护神经细胞损伤。本研究发现Aloin可以显著改善CIRI大鼠的神经功能，提高存活率，提示Aloin可以保护CIRI大鼠的神经功能。Palencia等[13]的研究表明，CIRI后高水平的炎症反应、氧化应激、蛋白酶激活等均会诱导细胞凋亡。本研究发现，CIRI大鼠脑组织缺血区出现明显病变，伴随大量炎性细胞浸润，并出现细胞凋亡，经Aloin治疗后，病变明显减轻，脑组织细胞凋亡率显著降低，提示Aloin能抑制脑组织细胞凋亡，改善CIRI大鼠脑组织损伤。

已有研究发现，CIRI早期机体的氧自由基、前炎症细胞因子(如IL-1β、TNF-α)等多种因素可特异性激活NF-κB，激活的NF-κB进入胞核与靶序列结合，可以促进IL-6、IL-8、TNF-α、ICAM-1等炎性细胞因子的表达，加重脑组织损伤[14]。IL-6是一种主要由单核-巨噬细胞分泌的前炎症因子，可促进多种炎症因子的生成，在继发性脑损伤中发挥重要作用[15]。IL-10是一种炎性抑制因子，能全面抑制炎性细胞因子IL-6、IL-1等受体的表达，减轻组织损伤[16]。ICAM-1为脑损伤后的主要促炎性因子，CIRI后ICAM-1即可与白细胞上的巨噬细胞活化趋化因子-1(Mac-1)和淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)结合，使大量白细胞与微血管内皮细胞发生黏附，导致再灌注损伤[17]。黄小平等[18]的研究表明，CIRI小鼠NF-κB被激活，脑组织 TNF-α、IL-1β、ICAM-1等炎症因子具有高表达。Luo等[19]的研究表明，Aloin可以抑制NF-κB信号通路，抑制脂多糖诱导的炎症反应和细胞凋亡。本研究发现Aloin可以降低CIRI大鼠脑组织中高表达的ICAM-1和IL-6，升高CIRI大鼠脑组织中低表达的IL-10，从而降低机体的炎症因子水平，与上述研究一致，提示Aloin可以改善CIRI大鼠的炎症反应。

已有研究表明，CIRI后NF-κB信号通路被激活，NF-κB/p65被释放，进而促进下游多种黏附分子、炎症因子等表达，过表达的这些细胞因子均可反馈性加重CIRI损伤[20]。杨擎等[21]的研究表明，激活NF-κB可以上调下游靶基因TNF-α的表达，激活细胞凋亡的级联反应，诱导细胞凋亡。TNF-α主要由巨噬细胞和T淋巴细胞产生，是一种能直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因子，参与脑缺血后的多种病理反应，包括脑水肿、血脑屏障损伤、炎症反应、细胞凋亡等[22]。Li等[23]的研究表明，TNF-α可以激活NF-κB p65和凋亡基因Bax的转录，一旦NF-κB p65沉默后，则可以抑制TNF-α诱导的细胞凋亡。Carotenuto等[24]的研究表明，TNF-α可以调控凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax和Caspase-3的表达，调控细胞凋亡。Caspase家族是凋亡执行分子，活化的Caspase可以降解细胞内的重要蛋白，诱导细胞凋亡[25]。Lee等[26]的研究表明，Aloin可以诱导非小细胞肺癌细胞的细胞周期阻滞、细胞凋亡和自噬。本研究发现，Aloin可以下调CIRI大鼠脑组织中高表达的磷酸化和非磷酸化的NF-κB p65、TNF-α、Caspase-3和Caspase-9，抑制细胞凋亡，提示Aloin可能通过抑制NF-κB p65的磷酸化，抑制下游靶基因TNF-α的表达，从而抑制TNF-α所诱导的凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达。

综上所述，Aloin可以抑制NF-κB p65的磷酸化，抑制下游靶基因TNF-α的表达，抑制凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达，降低CIRI大鼠体内过高的炎症反应，有效改善CIRI大鼠的神经功能，提高CIRI大鼠的存活率，为临床上Aloin治疗CIRI提供一定的理论依据。