MicroRNAs与胸腺细胞发育的研究进展①

胡 琳 冒 灵 刘士明 陈 超 徐 林

(贵州省基因检测与治疗特色重点实验室，遵义医科大学免疫学教研室，遵义563099)

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度约为22～24个核甘酸(nucleotide，nt)。成熟的miRNAs能够和互补或部分互补的靶mRNA的3′末端非翻译区(3′untranslationalregion,3′UTR)结合，在转录后水平促进靶mRNA降解或介导其翻译抑制，从而发挥广泛的生理调控功能[1]。在人类，目前报道有1 000多个miRNAs家族分子，参与调控细胞的发育分化、增殖、凋亡及肿瘤的发生、发展等重要的生物学进程。新近大量研究显示miRNAs分子在胸腺细胞发育过程中发挥了重要调控作用，提示其在机体免疫系统发育中的重要性。

1 胸腺细胞发育基本过程

胸腺是人或其他哺乳类动物的中枢免疫器官，是免疫细胞发育、分化以及成熟的重要场所。T淋巴细胞(T-lymphocyte)，简称T细胞，其来源于骨髓或胚肝淋巴样干细胞分化发育的早期T细胞系前体(Early T lineage precuesor,ETP)，在胸腺中进一步发育成熟，继而迁移至外周免疫器官发挥其生物学功能[2-4]。T细胞在胸腺发育的过程中，基于CD4和CD8的差异性表达，其发育分化过程可分为三个阶段，如图1所示，早期T细胞表型为CD4-CD8-双阴性(Double negative cell，DN)，主要在皮质区域分化；随后，双阴性T细胞分化为CD4+CD8+双阳性细胞(Double positive cell，DP)，开始表达T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)，逐渐进入髓质，而后经阳性选择获得MHC限制性识别能力，经阴性选择获得对自身抗原的耐受性；最终发育为成熟的、仅表达CD4或CD8的单阳性(Single positive cell，SP)T细胞，然后迁出胸腺，经血流运输至周围淋巴器官或淋巴组织定居，并发挥相应的免疫功能。

2 miRNAs与胸腺细胞发育的关系

研究表明，T细胞成熟早期(DP阶段)miRNAs总体水平的升高与细胞总RNA含量的增加相一致，提示其表达与胸腺细胞发育存在关联[5]。Cobb等[6]进一步发现，在胸腺细胞发育早期(DN到DP阶段)，条件性缺失T细胞中miRNAs生成所需的关键酶Dicer将导致αβT细胞数量减少(而γδT细胞不受影响)，从而使DP阶段胸腺细胞数减少。此外，脾脏中CD4和CD8 SP T细胞数以及外周血中总CD3+T细胞数均减少[6,7]。然而，单个miRNAs在不同的胸腺细胞亚群(DN、DP、SP)中表现为动态变化[5,8]。并且，在胸腺细胞发育过程中单个miRNAs水平的增加与其靶基因的缺失呈负相关[5,8]。这些研究表明特定miRNAs分子参与了胸腺细胞的发育过程(图2)。

2.1miRNA-181与胸腺细胞 在miR-181a 过表达小鼠模型中，外周循环的T细胞数量明显下降，其中CD8+T细胞的下降达到90%[9]，这提示miR-181a在T细胞的发育中可能发挥着重要作用。Liu等[10]对miR-181a-1和miR-181c的功能分析表明，miR-181a-1在胸腺祖T细胞(pro-T)中过表达，能促进CD4-CD8-DN向CD4+CD8+DP细胞的发育，而miR-181c不具有这样的功能，可能是miR-181a-1独特的miRNA前体(pre-miRNA)茎环核苷酸序列决定了其功能的特异性。Neilson等[5]进一步研究发现，miR-181a在胸腺细胞发育的CD4+CD8+DP阶段特异性富集；且miR-181a 能通过抑制B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)和CD69等的表达，进而影响它们协调参与CD4+CD8+DP的阳性选择过程[11]。

图1 胸腺细胞的发育过程Fig.1 Basic process of thymocyte developmentNote: Schematic representation showing the different cell surface markers expressed in key stages of T-cell development in mouse thymus,including DN,DP,and SP stages.BM,bone marrow.

TCR的敏感性对于T细胞的阳性和阴性选择具有重要作用。Li等[12]研究证实，在成熟的T细胞中miR-181a表达上调后，T细胞对抗原肽的敏感性会随之提高，同时增强细胞内钙离子的外流和细胞因子IL-2的产生；而在未成熟T细胞中miR-181a表达下调则可降低T细胞对抗原肽的敏感性，同时可削弱胸腺细胞发育的阴性、阳性选择；此外，miR-181a对T细胞敏感性的定量调节能使成熟T细胞将拮抗剂(抑制性抗原肽)识别为激动剂；接下来的研究发现，miR-181a能通过抑制酪氨酸和丝氨酸磷酸酶的表达，导致磷酸化中间产物的稳态提高，从而降低TCR的信号阈值，增强其敏感性；进一步的分析显示，miR-181a下调了多种磷酸酶基因的表达；重要的是，miR-181a的高表达与未成熟T细胞的敏感性相关，这提示miR-181a在T细胞的发育过程中可能充当着抗原敏感性的内在“变阻器”。Ebert等[13]研究还发现，抑制miR-181a表达可促进T细胞与参加阳性选择自身肽段的反应，从而导致T细胞的成熟，同时，miR-181a通过调节胸腺细胞TCR信号的阈值来防止中度亲和力克隆的缺失，保证阳性选择的顺利进行。

2.2miRNA-150与胸腺细胞 人和小鼠的miRNA表达谱显示，在T细胞成熟过程中，miR-150水平明显上调[8,14]。Zhou等[15]研究进一步发现miR-150在胸腺细胞的CD4-CD8-DN阶段低表达， 在CD4+CD8+DP阶段和CD8+T细胞中适度表达，而在CD4+T细胞中则高表达，miR-150的这种动态变化提示其可能对胸腺细胞的发育具有调控作用。在miR-150转基因小鼠中，miR-150的过度表达使得小鼠胸腺细胞的发育受阻，特别是DN3到DN4的发育受阻，最终导致CD4+T和CD8+T细胞数量减少[14]。在探讨机制方面，研究者发现转录因子c-Myb (c-myeloblastosis) 是miR-150的一个重要靶分子，在未成熟T细胞中miR-150过表达时，c-Myb表达下调[14]。除c-Myb外，NOTCH 3也是miR-150的一个重要新靶分子，它是T细胞分化的主要调控因子，可使T细胞增殖和存活下降[8]。这些研究均表明miR-150在T细胞成熟过程中发挥了重要调控作用。

图2 不同的miRNA分子在胸腺细胞发育过程中的作用Fig.2 Role of different miRNAs in thymocyte developmentNote: Schematic is shown for the role of several miRNAs in thymocyte development.These miRNAs are involved directly or indirectly in the regulation of crucial aspects of T-cell activation,proliferation,and differentiation as depicted.

还有研究显示，miR-150也参与不同功能T细胞亚群的发育过程。如，不变的自然杀伤T(invariant nature killer T,iNKT)细胞是T淋巴细胞中独特的亚群，它们表达恒定的TCRVα14、NK细胞的部分标识CD161(NK1.1)分子和NK细胞受体NKR-P1C。Zheng等[16]研究发现，在iNKT细胞成熟、活化过程中，miR-150表达上调；进一步研究发现，在miR-150敲除(Knock out,KO)小鼠模型中，胸腺中iNKT细胞的成熟受损；随后的骨髓细胞过继转输实验也证实miR-150 KO可导致iNKT细胞成熟和功能发生变化。Bezman等[17]进一步利用miR-150过表达模型小鼠研究，亦得出了相似的结论。以上研究表明，miR-150在iNKT细胞的发育和功能中发挥着重要作用。然而，其是否也参与其他T细胞亚群发育还有待研究阐明。

2.3miRNA-146与胸腺细胞 正常生理状态下，miR-146a在包括T细胞在内的多种免疫细胞中存在表达[18]。研究报道，在骨髓淋巴祖细胞发育的早期，miR-146a过表达可损害造血干/祖细胞的发育过程，最终导致外周血中CD4+T细胞数量减少[19]。此外，Krigin等[20]研究发现，miR-146a的表达水平在胸腺不同发育阶段的胸腺细胞中存在差异。Li等[21]利用miR-146a过表达模型小鼠进一步研究发现，miR-146a过表达可促进T细胞增殖，减少T细胞凋亡。更重要的是，在这种模型小鼠中，产生中枢耐受的关键过程——胸腺细胞的阳性选择被削弱，使得CD4+CD8+DP T细胞增多，而CD4+SP和CD8+SP T细胞减少。且CD8+SP T细胞的成熟过程亦被削弱，从而导致CD8+SP T细胞比CD4+SP T细胞丢失更严重。以上研究表明，miR-146a可通过骨髓淋巴祖细胞和胸腺细胞发育两个环节来调控胸腺细胞的发育，然而其相关靶分子机制仍待深入研究。

2.4miRNA-17～92与胸腺细胞 MiR-17～92是由6个miRNA组成的簇(miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1)。在骨髓中，miR-17～92在淋巴样细胞中的过度表达可导致细胞过度增殖，进而影响淋巴样细胞向胸腺的迁入，导致胸腺细胞的发育异常[22]。此外，Xiao等[22]构建了DN1 T细胞过表达miR-17～92的模型小鼠，发现该小鼠其外周T淋巴细胞的数量发生明显改变，以CD4+T细胞的变化最为显著，提示miR-17～92参与了胸腺细胞的发育过程。Regelin等[23]进一步利用miR-17～92Δ/Δ小鼠研究发现，缺乏miR-17～92的胸腺细胞，其早期发育过程严重缺陷，特别是DN向DP的分化过程受阻明显。这些研究提示，miR-17～92对胸腺细胞的发育具有重要调控作用，可能与CD4+T细胞的发育更为相关。然而，其在胸腺细胞发育各阶段中的确切作用及相关机制仍未阐明。

2.5miRNA-155与胸腺细胞 天然调节性T细胞(natural regulatory T cells，nTreg)是淋巴细胞在胸腺成熟过程中产生的CD4+T细胞，它表达CD25分子。这些细胞在胸腺发育成熟后经血流运输至外周淋巴器官，发挥相应的免疫功能。研究发现，miR-155在nTreg细胞发育中发挥重要调控作用[24-26]。在miR-155 KO小鼠中，其胸腺和外周淋巴器官的nTreg细胞数量减少；不仅如此，miR-155缺乏的nTreg细胞增殖能力也明显削弱[24,27]。IL-2是nTreg细胞发育和存活的关键因素[28-30]。进一步的研究发现，miR-155可通过增强nTreg对IL-2的敏感性，增加信号转导和转录活化蛋白5(Signal transduction and activator of transcription 5,STAT5)信号途径传递，从而促进nTreg细胞在胸腺和外周的存活和增殖[27]。有意思的是，Kohlhaas等[24]还发现叉头蛋白3(Forkhead box protein 3，Foxp3)可调控nTreg中miR-155的表达。鉴于STAT5信号途径在Foxp3表达中的重要性[31]，因此，我们推测miR-155、STAT5和Foxp3三者间形成调节环路，共同调控nTreg的发育过程。此外，Sánchez-Díaz等[32]研究还发现，C型凝集素相关途径也可以通过miR-155的表达来调节nTreg的胸腺发育过程，提示miR-155分子参与nTreg胸腺发育过程的复杂性。

此外，新近研究还报道miR-155参与了iNKT细胞的胸腺发育过程。Burocchi等[33]利用miR-155过表达模型小鼠研究发现，miR-155过表达可使胸腺中iNKT细胞发育成熟障碍，表现为未成熟的iNKT细胞大量滞留于其在胸腺发育的第二阶段(CD24lo

表1 与胸腺细胞发育相关的miRNAs和其靶分子及效应

Tab.1 miRNAs and their targets and effects in development of thymocytes

miRNATargetEffectsSpeciesReferencesmiR-181aPTPN22 DUSP5/6 SHP-2Increases TCR sensitivity,regulates positive selectionMouse[12,13]miR-150NOTCH3Regulates pre-TCR and NFκB signalingHuman[8]c-MybBlocks DN3 to DN4Mouse[14]miR-155SOCS1Promotes Treg survival and thymic developmentMouse[24,27]CD69Promotes Treg cell development and homeostasisMouse[32]ItkMediates TGFβ signaling in intestinal lamina propria T cellsHuman[40]No reportPromotes Th17 polarizationMouse[41]Ets1,ItkBlock the maturation of iNKT cellsMouse[33]miR-146aGimap4Impairs the positive selection during T cell development;Mouse[21]STAT1Inhibits IFNγ signaling in TregsMouse[42]miR-17～92IL-7RReduces cell survival of common lymphoid progenitors and thymocytes at the DNto DP transitionMouse[23]CREB1 TGFβRⅡ PTENInhibits formation of iTregsMouse[43]miR-4281Foxp3Accelerates the differentiation of human naive cells to induced Tregs (iTregs)Mouse[31]miR-142Cdkn1bControls the early and mature thymocyte proliferationMouse[34]miR-125bBmf KLF13Regulates HSC survival and promote lymphoid-fate decisions at the level of the HSCMouse[35]miR-205Forkhead-Box N1Promotes T cell developmentMouse[36]miR-223E2F1 MEF2C TOXContributes to the development of T cellsMouse[37]miR-133bTh-POKRegulates the differentiation of NKT17 cell in thymusMouse[38]miR-126IRS-1Regulates the development of CD4+ SP cellsMouse[39]miR-873Foxo1Facilitates the differentiation of CD4+ T cells into Th17 lineageHuman[44]miR-29aDkk Kremen2 sFRP2Promotes canonical Wnt signaling in osteoblastsHuman[45]miR-34Wnt1 Wnt3 β-cateninSuppresses canonical Wnt signaling in epithelial and breast cancer cellsHuman[46]miR-10aBcl-6Restrictes Treg cell differentiation into Th17 cellsMouse[47]

Note：PTPN22.Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 9;DUSP5/6.Dual specificity phosphatase 5/6;SHP-2.SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2;c-Myb.c-myeloblastosis;SOCS1.Suppressor of cytokine signaling 1;Itk.Interleukin-2 inducibile T-cell special kinase;Ets1.E26 transformation-specific factor-1;Gimap4.GTPase IMAP family member 4;STAT1.Signal transduction and activator of transcription 1;IL-7R.Interleukin-7 receptor;CREB1.cAMP responsive element binding protein 1;TGFβRⅡ.Transforming growth factor β receptorⅡ;PTEN.Phosphatase and tensin;Foxp3.Forkhead box protein 3;Cdkn1b.Cyclin dependent kinase inhibitor 1B;Bmf.Bcl2 modifying factor;KLF13.Kruppel-like factor 13;E2F1.E2F transcription factor 1;MEF2C.Myocyte-specific enhancer-binding factor-2C;TOX.Thymocyte selection associated high mobility group box;Th-POK.T helper-inducing POZ/Kruppel-like factor;IRS-1.Insulin receptor substrate 1;Foxo1.Forkhead box O1;Dkk.Dickkopf WNT signaling pathway inhibitor;Kremen2.Kringle containing transmembrane protein 2;sFRP2.secreted Frizzled-related protein 2;Wnt1.Wingless type 1;Wnt3.Wingless type 3;Bcl-6.B cell lymphoma-6.

CD44hiNK1.1-)，从而导致迁移至外周的iNKT细胞数量减少。进一步研究亦发现，在该模型小鼠的iNKT细胞成熟过程中，miR-155的两个靶分子E26转化特异因子1(E26 transformation-specific factor-1,Ets1)和白介素2 诱导T细胞特异激酶(Interleukin-2 inducibile T-cell special kinase,Itk)的表达下调。然而，确切的调控机制还有待阐明。

2.6其他miRNAs与胸腺细胞 除上述的miRNAs家族分子外，其他miRNAs成员也参与了胸腺细胞发育的调控过程(见表1)。如，miR-142是一种进化保守的miRNAs，可在造血组织中选择性表达。Mildner等[34]研究表明，miR-142表达缺失可影响细胞的稳态。进一步地分析发现，miR-142为胸腺细胞前体发育和T细胞成熟所必须。miR-142缺乏可引起胸腺细胞前体的发育停滞，导致胸腺细胞增殖分化过程受损，细胞大量滞留在DP阶段。再如，miR-125b在淋巴干细胞中的表达程度高于髓系干细胞和造血干细胞。这种高表达促进了淋巴细胞谱系的发育，并参与了造血干细胞的存活和淋巴平衡的维持[35]。又如，miR-205可通过调节叉头盒N1(Forkhead box N1)和特定的趋化因子促进应激后的T细胞发育[36]。miR-223则可通过与原癌基因的协调作用，进一步调控T细胞的发育过程[37]。而miR-133b可通过调节T细胞辅助诱导POZ/Kruppel样因子(T helper-inducing POZ/Kruppel-like factor,Th-POK)表达和树突状细胞信号来调控NKT17细胞在胸腺中的分化[38]。最近我们利用miR-126 KO模型小鼠研究也发现，miR-126 KO后，可通过上调其靶分子胰岛素受体底物来调控胸腺CD4+SP T细胞的发育[39]，这些研究进一步显示了miRNAs家族分子参与胸腺细胞发育过程的复杂性。

3 小结

近年来，一系列研究表明miRNAs分子在胸腺细胞发育过程中发挥了重要调控作用，涉及到骨髓中淋巴祖细胞发育，以及胸腺中胸腺细胞的DN/DP、阳性和阴性选择等各阶段的发育。然而，仍有许多科学问题有待进一步阐明。如，这些miRNAs分子在参与胸腺细胞不同阶段发育的过程中确切相互关系如何，相关分子机制又如何，以及这些miRNAs分子的表达调控机制是怎样的；特别是miRNAs参与胸腺细胞发育与临床疾病发生之间的内在联系，以及如何开展基于miRNAs分子的相关临床疾病的免疫生物治疗，等等。这些科学问题的后续阐明，不仅将极大提升人们对miRNAs生物学功能和胸腺细胞发育调节机理的认识，且对后续相关临床疾病的免疫生物治疗新策略开发也具有重要意义。