孕前外周血淋巴细胞亚群与IVIG治疗反复妊娠失败患者妊娠结局的相关性①

李阳阳 朱 丹 阮加里 鲍时华

(同济大学附属第一妇婴保健院生殖免疫科，上海201204)

复发性流产 (Recurrent spontaneous abortion,RSA) 是指连续发生2次或2次以上的自然流产[1]。反复移植失败(Repeated implantation failure，RIF)目前被定义为移植至少3次新鲜或冷冻周期(至少4个优质胚胎)着床失败,或移植优质胚胎3次或胚胎数目大于10个以上失败[2]。临床上习惯将RSA和RIF合并称为反复妊娠失败(Recurrent reproductive failure，RPF)。尚没有针对RPF的规范化诊疗指南或专家共识，一般认为适用于RSA的病因筛查和治疗策略同样也适用于RPF。1994年人们首次尝试用静脉注射免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulin，IVIG)治疗RSA患者[3]，随后研究者们在临床上不断进行深入研究，继而IVIG逐渐被用于治疗免疫异常的RPF患者，然而不同研究观察到的治疗效果却不相同。

越来越多的证据表明RPF的发生与母体免疫系统的紊乱存在密切联系[4]，而淋巴细胞是机体免疫系统的重要组成部分。其中，T细胞(CD3+T cell)主要参与细胞免疫应答；B细胞(CD19+B cell)则与体液免疫息息相关。为了探讨淋巴细胞亚群水平与IVIG治疗RPF患者妊娠结局的相关性，本文采用回顾性队列研究设计，收集患者临床基本资料、外周血淋巴细胞亚群水平、IVIG治疗方案以及妊娠结局，分析临床基本资料和淋巴细胞亚群与IVIG治疗预后的关系，为临床诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1临床资料 采用回顾性队列研究方法，纳入2014年1月至2016年12月上海市第一妇婴保健院生殖免疫科接受IVIG治疗的RPF患者1 046例，随访截止日期为2017年12月。纳入标准：①25～49周岁女性；②病史完整；③RSA次数≥2次和/或RIF≥3次的患者；④接受IVIG治疗；⑤相关生殖免疫检查结果完整。排除标准：①3个月内有严重过敏史、外伤史、手术史者；②有精神疾病史或精神疾病家族史者；③研究期间发生2次及2次以上受孕者；④未孕、宫外孕和生化妊娠者；⑤近期使用免疫抑制剂的患者。本研究经上海市第一妇幼保健院伦理委员会审核批准，患者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1治疗方案 本研究为描述性回顾分析，无实验性地干预临床治疗。针对患者不同的病因，均采取针对性处理，比如子宫解剖异常患者，行宫腔镜治疗等。目前IVIG治疗国际上并无统一治疗方案，本科室将IVIG作为二线治疗，均在常规阿司匹林和/或低分子肝素治疗失败后，再次备孕或受孕时使用IVIG治疗。具体来说，孕前方案为RSA患者在排卵期开始使用，RIF患者在移植前1周使用，均相当于着床前7 d左右。孕后方案在确认妊娠后即开始使用。一般按每千克体重250～300 mg计算IVIG使用剂量，2周1次，使用2～3次。

1.2.2资料收集 所有患者均按复发性流产诊治的专家共识开展全面的病因筛查[5]，主要分为以下8类病因，流行病学因素(包括既往流产史、孕妇年龄等)、解剖结构因素(如宫腔黏连、弓形子宫、单角子宫等)、血栓前状态(包括蛋白S缺乏、蛋白C缺乏、抗凝血酶原Ⅲ缺乏等)、遗传因素(包括夫妇染色体异常和胚胎染色体异常)、内分泌因素[如胰岛素抵抗(IR)、甲减、高雄激素血症、糖尿病、高泌乳素血症等]、感染因素、免疫因素[包括自身免疫型RSA，如抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome，APS)、不典型APS(即有相关抗体阳性，但尚未达到诊断标准)、桥本氏甲状腺炎(Hashimotos thyroiditis，HT)、未分化结缔组织病(Undifferentiated connective tissue disease，UCTD，指的是具有结缔组织病的特征、但又不符合特定疾病的诊断[6])和同种免疫型RSA(如自然杀伤细胞数量及活性升高、Th1/Th2细胞因子异常等)]，以及不良环境和生活习惯。最后，我们将经上述包括免疫和凝血等病因筛查后，仍未发现病因的归入不明原因RPF(Unexpressed RPF,URPF)。

1.2.3淋巴细胞亚群检测 检测试剂由BD Science公司提供(BD Multitest CD3 FITC/CD8 PE/CD45PerCP/CD4 APC and CD3 FITC/CD16 PE+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC)，采用流式细胞仪(BD FacsCaliburTMFlow Cytometer,USA)对外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+、CD19+淋巴细胞亚群水平进行检测，操作按说明书进行。结果用各细胞亚群占总淋巴细胞百分比来表示，由Multitest分析软件自动完成。

2 结果

2.1患者资料 经筛选，符合本研究且完成随访，可以进入统计分析的受试者共有1 046例，包括RSA患者850例(占总数81.26%)、RIF患者196例(占总数18.74%)。临床基线资料如表1所示，按妊娠结局分成活产组和流产组。RPF总体活产率为58.99% (617/1 046)，其中RSA的活产率为62%(527/850)、RIF的活产率为45.92%(90/196)，RSA组的活产率显著高于RIF组。按不同病因来看，不明原因和自身免疫因素中活产率相对较高，分别为63.64%和57.21%，细胞免疫异常中活产率为53.98%(图1)。

流产组患者年龄高于活产组(P<0.001)；流产组患者BMI高于活产组(P=0.01)；流产组患者曾经流产次数高于活产组(P<0.001)。此外，是否存在解剖结构异常、是否有细胞免疫异常活产率不同、曾经移植失败次数、内分泌因素、自身免疫因素、血栓前状态及不明原因因素均与活产率无关。

表1 1046例反复妊娠失败患者临床基本特征与妊娠结局之间的关系

Tab.1 Relationship between clinical basic characteristics and pregnancy outcomes

VariableLive birth(n=617)Miscarriage(n=429)P-valueDiagnosis<0.001RSA527(85.41%)323(75.29%)RIF90(14.59%)106(24.71%)Age(year)32.62±4.5435.16±5.73<0.001BMI(kg/m2)21.70±3.4322.15±2.610.01The number of RSA3.22±1.463.66±1.71<0.001The number of RIF4.42±1.954.92±2.410.07Chromosome abnormal1)Absent610(98.87%)417(97.20%)Present7(1.13%)12(2.80%)Endocrine Absent428(69.37%)278(64.85%)0.13Present189(30.63%)151(35.15%)AnatomyAbsent568(93.73%)370(87.89%)0.001Present38(6.27%)51(12.11%)AutoimmuneAbsent375(60.78%)248(57.81%)0.33Present242(39.22%)181(42.19%)Cellular immunity2)Absent389(63.04%)234(54.55%)0.007Present228(36.96%)195(45.45%)Infections1)Absent614(99.51%)428(99.77%)Present3(0.49%)1(0.23%)HemagglutinationAbsent500(81.04%)331(77.16%)0.14Present117(18.96%)98(22.84%)URPFAbsent525(85.09%)376(87.65%)0.22Present92(14.91%)53(12.35%)Time of IVIG started Before pregnancy495(80.17%)280(65.22%)0.17During pregnancy122(19.83%)149(34.78%)

Note：1)Further statistical analysis was not performed because the number of patients with chromosomal abnormalities or infection is less than 10;2)The diagnostic criteria for abnormal cellular immunity are based on the reference range of peripheral blood lymphocyte subsets in the normal women of childbearing age established in our laboratory:CD3+:63.04-77.98;CD3+CD4+:25.80-38.74；CD3+CD8+:21.30-34.38；CD16+CD56+:9.50-23.70；CD19+:8.08-15.20.

2.2淋巴细胞亚群水平在不同妊娠结局之间的比较 图2示患者淋巴细胞亚群水平在不同妊娠结局之间的比较。流产组孕前CD3+细胞为69.71±8.73(%)、活产组为67.16±9.46(%)，流产组CD3+细胞水平显著高于活产组(P=0.02)；流产组孕前CD19+细胞为12.18±4.14(%)、活产组为13.86±4.63(%)，流产组CD19+细胞水平显著低于活产组(P=0.03)；孕前CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+在两组之间均无显著性差异。

2.3单因素分析 单因素分析结果显示(表2)，年龄是RPF患者IVIG治疗预后的危险因素，年龄每增加1岁，流产风险增加10% (P<0.001)；曾经流产次数每增加1次，流产风险增加19% (P=0.002)。 与RSA相比， RIF患者流产风险增加92%(P<0.001)；在各类病因中，解剖结构异常和细胞免疫异常是RPF患者IVIG治疗预后的危险因素。从淋巴细胞亚群水平看，孕前CD3+和CD19+细胞与妊娠结局有关，孕前CD3+细胞每增加1%，患者流产的风险增加2%(P=0.02)；孕前CD19+细胞每增加1%，患者流产风险下降3%(P=0.03)。

图1 不同病因反复妊娠失败患者IVIG治疗活产率Fig.1 Live birth rate of patients with recurrent reproductive failure after IVIG treatmentNote: Couples with chromosomal abnormalities or infection factors in the group of patients less than 10 were not analyzed

图2 淋巴细胞亚群水平在不同妊娠结局之间的比较Fig.2 Comparison of lymphocyte subsets between different pregnancy outcomesNote: *.P=0.02；**.P=0.03.

表2 淋巴细胞亚群水平、临床基本特征与妊娠结局关系的单因素分析

Tab.2 Univariate analysis of relationship between lympho-cyte subsets or clinical basic characteristics and pregnancy outcomes

VariableORP-valueAge(year)1.10(1.07,1.13)<0.000 11)BMI(kg/m2)1.05(0.98,1.12)0.18Number of RSA1.19(1.09,1.31)0.000 21)Number of RIF1.11(0.99,1.24)0.07Diagnosis RSA1.0 RIF1.92(1.40,2.63)<0.000 11)Chromosome abnormal Absent1.0 Present2.30(0.88,5.97)0.09Endocrine Absent1.0 Present1.22(0.94,1.59)0.13Anatomy Absent1.0 Present2.06(1.33,3.20)0.0011)Autoimmune Absent1.0 Present1.13(0.88,1.46)0.34Cellular immunity Absent1.0 Present1.42(1.10,1.82)0.0071)Infections Absent1.0 Present0.48(0.05,4.62)0.53Prethrombotic state Absent1.0 Present1.26(0.93,1.71)0.14URPF Absent1.0 Present0.80(0.55,1.15)0.22Time of IVIG started Before pregnancy1.0 During pregnancy1.05(0.51,2.19)0.89CD3+ cells(%)1.02(1.00,1.03)0.02CD3+CD4+ cells(%)1.02(1.00,1.03)0.08CD3+CD8+ cells(%)1.00(0.98,1.02)0.66CD16+CD56+ cells(%)0.99(0.98,1.01)0.37CD19+ cells(%)0.97(0.93,1.00)0.03

表3 CD3+及CD19+细胞百分数与妊娠结局关系多元回归方程分析

Tab.3 Multiple regression equation analysis of relations-hip between CD3+or CD19+cell percentage and pregnancy outcome

VariableNon-adjusted1)OR(95%CI) PAdjust2)OR(95%CI) PCD3+1.03(1.00,1.17) 0.021.04(1.01,1.29) 0.01CD19+0.95(0.93,0.99) 0.030.95(0.90,0.98) 0.04

Note：1)Non-adjusted model adjust for:None;2)Adjust model adjust for:age,BMI,the number of RSA,the number of RIF,diagnois,chromosome abnormal,endocrine,anatomy,autoimmune,infections,hemagglutination,URPF and time of IVIG started.

2.4多元回归分析 单因素分析结果提示：年龄、临床诊断(RSA或RIF)、曾经流产次数、是否存在解剖异常、是否存在免疫异常都是影响妊娠结局的因素，为了评价外周血淋巴细胞亚群水平与妊娠结局之间的独立作用大小，我们应用多元回归方程，将上述可能的影响因素作为调整变量。表3示，在调整了年龄、BMI、流产或移植失败次数、不同病因以及IVIG用药开始时间后，孕前CD3+细胞水平仍然是RPF患者IVIG治疗妊娠结局的独立危险因素，方程显示：CD3+细胞水平每增加1%，患者流产风险增加4%(P=0.01)；孕前CD19+细胞仍然是RPF患者IVIG治疗妊娠结局的独立保护因素，CD19+细胞水平每增加1%，患者流产风险下降5%(P=0.04)。

3 讨论

复发性流产在育龄期女性中的发生率约为5%，约1%的女性经历3次或3次以上的流产[1]，严重影响了育龄期女性的身体和心理健康。母体免疫系统能够对半同种异体胚胎不产生排斥，并且能够保护母体和胎儿免受外界病原菌的侵袭，主要依靠母体免疫系统的激活与耐受达到平衡[7]。近年来，生殖免疫学领域的大量研究表明，免疫功能紊乱是RSA、RIF以及其他妊娠并发症的病因之一[8-10]。研究发现RPF患者的T细胞比值存在异常,CD4+T细胞中Th1/Th2平衡向Th1偏离[11]。同时B细胞，特别是B-1a B细胞，可以使T细胞激活或耐受，也在妊娠中发挥重要作用[12]。另有多篇文献报道，与正常育龄期女性相比，RPF患者外周血和子宫内膜中NK细胞比例和毒性增加[13,14]。目前临床上治疗免疫因素导致RPF的药物主要有阿司匹林、低分子肝素以及静脉注射免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulin，IVIG)等。前两种药物的治疗效果已经在临床上获得了一致认可，而静脉注射免疫球蛋白仍存在争议。临床上常根据外周血Th1/Th2比例，CD56+CD3-细胞比例等来评估是否采用IVIG治疗。因此，测定孕前外周血淋巴细胞亚群水平对预测IVIG治疗RPF患者的流产风险具有重要意义。

3.1淋巴细胞亚群与妊娠结局的关系 研究表明，T细胞亚群水平与妊娠结局相关，Th1/Th2、 Th17/Treg细胞比例失调会导致RPF的发生[15]。Winger等[16]研究发现，Th1/Th2或CD56+细胞比例升高的患者经IVIG治疗后，IVF的妊娠结局明显改善，而孕前细胞比例正常的患者，是否使用IVIG治疗成功率没有差异，提示孕前外周血Th1/Th2与CD56+比例可以用于预测IVIG的治疗效果。近期研究指出[17,18]，IVIG能够调节Th1/Th2、Th17/Treg平衡、增强Th2、Treg细胞的功能，从而改善RPF患者的妊娠结局。本研究结果显示，外周血淋巴细胞亚群中总T水平是反复妊娠失败患者IVIG治疗预后的独立危险因素，在调整了年龄、BMI、流产或移植失败次数、不同病因以及IVIG用药开始时间等可能混杂因素后，孕前CD3+细胞水平每增加1%，患者流产风险增加4%。另外结果提示孕前NK细胞水平与妊娠结局无关，考虑我们选择的患者群体不同所致。

而外周血淋巴细胞亚群中B细胞水平是反复妊娠失败患者IVIG治疗预后的独立保护因素，在调整了年龄、BMI、流产或移植失败次数、不同病因以及IVIG用药开始时间等可能混杂因素后，孕前CD19+细胞水平每增加1%，患者流产风险下降5%。文献表明，B淋巴细胞一方面能够分泌IgG类妊娠保护性抗体，另一方面通过分泌免疫调节细胞因子IL-10促进妊娠耐受，从而保护胎儿使妊娠得以继续维持[19,20]。近期有研究发现，浆细胞同种异体抗原1(Plasma cell alloantigen 1,PC1)(一种Ⅱ型跨膜糖蛋白)的表达水平与B细胞亚群分泌IL-10的能力密切相关，PC1高表达的B细胞比PC1 低表达的B细胞分泌更多的IL-10，能够维持胎儿存活，而PC1低表达的B细胞则可能损害胎儿的健康[21]。Jablonowska等[22]对妊娠6～8周的RSA患者进行外周血淋巴细胞亚群检测，接着给予患者IVIG或安慰剂治疗，在分娩或流产后再次检测淋巴细胞水平，结果显示2次外周血B细胞水平与妊娠结局均无明显关系。这提示，不同时期，不同亚群的B淋巴细胞水平可能与IVIG治疗结局的关系不同。

3.2其他因素 在临床基线资料中，患者年龄是影响妊娠结局的危险因素，与文献中年龄与不良妊娠结局相关的结论相一致[23,24]，所不同的是我们提供了效应值，即年龄每增加1岁，发生流产的风险增加10%。关于既往流产次数对妊娠结局的影响，有文献报道既往无流产史、流产1次和流产2次以上的3组患者间保胎成功率的差异均无统计学意义(P>0.05)[24]。Lee等[25]研究表明，对于2、3、4、5次流产患者，IVIG治疗成功率并没有明显不同(范围为84.6%至89.7%)，6次以上的成功率相对较低(62.5%)，但与2、3、4、5次的成功率没有统计学差异。我们将既往流产次数对妊娠结局的影响进行了量化，发现流产次数每增加1次，再次发生流产的风险增加19%。

综上所述，孕前CD3+T细胞可能是RPF患者IVIG治疗妊娠结局的独立危险因素，而孕前CD19+B细胞可能是其独立的保护因素，外周血淋巴细胞亚群检测对预测IVIG治疗妊娠结局有一定的临床价值。IVIG治疗RPF有较好的前景，需进一步探讨RPF的发病机制、IVIG治疗RPF的作用机制和预后判断指标，并需要更多高质量且针对IVIG治疗RPF的适合人群、人种、用药剂量和用药时机的前瞻性随机对照试验来证实其有效性。