抑制LncRNA MALAT1靶向促进miR-200a表达减少心肌细胞凋亡

李家睿 闫波

(1山东大学齐鲁医学院心血管内科,山东 济南 250012;2济宁医学院附属医院中心实验室)

心肌细胞损伤是心血管系统疾病常见的病理变化〔1〕。目前研究认为，氧化应激是引起心肌损伤的重要原因，其可以诱导细胞凋亡发生，从而导致心肌组织完整结构受到破坏，引起心肌功能损伤〔2〕。LncRNA是近年来发现的与人类生理和病理功能密切相关的非编码RNA，其参与调控细胞的分化、凋亡等过程〔3〕。LncRNA 肺腺癌转移相关转录因子(MALAT)1最先在非小细胞肺癌细胞中发现，参与肿瘤进展〔4〕。研究发现，MALAT1还参与内皮细胞生长、动脉粥样硬化、视网膜病变等生理和病理过程〔5～7〕。最近研究显示，MALAT1在心肌细胞损伤过程中表达上调，下调MALAT1能够抑制脂多糖(LPS)诱导的心肌细胞凋亡〔8〕。目前对于MALAT1在氧化应激条件下心肌细胞凋亡中的作用尚不明确。本研究以过氧化氢(H2O2)处理心肌细胞构建氧化应激损伤模型，探讨MALAT1对氧化应激条件下心肌细胞凋亡的影响和机制。

1 材料与方法

1.1材料 心肌细胞H9c2购自湖南丰晖生物科技有限公司；cDNA合成试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen；MALAT1 siRNA、siRNA control、miR-200a mimics、mimics control由吉满生物科技(上海)有限公司合成；荧光素酶报告载体由南京科佰生物科技有限公司构建；miR-200a inhibitor、inhibitor control由苏州吉玛基因股份有限公司合成；丙二醛(MDA)含量测定试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)水平测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2Realtime PCR检测H2O2处理后心肌细胞中MALAT1表达 心肌细胞分别用0和100 μmol/L的H2O2处理，分别为Control组和H2O2组。细胞培养24 h后，Realtime PCR测定MALAT1表达变化。在细胞中添加Trizol试剂，提取细胞总RNA，RNA以RNase-free水溶解，使用紫外分光光度计检测RNA OD260/OD280的比值在1.8～2.0。取1 μg RNA模板，反转录合成cDNA，反转录步骤同cDNA合成试剂盒，反转录条件：42℃孵育60 min，72℃孵育10 min，-20℃保存备用。根据PCR引物进行SYBR Green实时定量PCR，PCR条件：95℃，2 min；95℃，15 s；60℃，20 s；72℃，20 s；共循环40次。MALAT1正义5′-GGTAACGATGGTGTCGAGGTC-3′，反义5′-CCAGCATTACAGTTCTTGAACATG-3′。GA-PDH正义5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，反义5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。

1.3细胞转染 取心肌细胞，放在37℃，5%CO2培养箱中培养，细胞密度生长到60%时，取出细胞培养板，按照Lipofectamine2000进行细胞转染，细胞转染步骤同转染试剂说明。将转染MALAT1 siRNA和siRNA control后的心肌细胞用含有100 μmol/L的H2O2培养液培养，记为H2O2+si-MALAT1组和H2O2+si-NC组。细胞培养24 h后，按照1.2中Realtime PCR方法测定细胞中MALAT1表达变化，评估下调效果。

1.4细胞凋亡检测 使用流式细胞术检测细胞凋亡变化，收集已经培养24 h的Control、H2O2、H2O2+si-NC、H2O2+si-MALAT1细胞，细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，添加提前在4℃预冷后的磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞悬浮2次，然后添加300 μl结合缓冲液，依次加入5 μl碘化丙啶(PI)和膜联蛋白(Annexin) V-FITC溶液，避光混匀。在上流式细胞仪检测之前添加100 μl结合缓冲液混匀。

1.5SOD和MDA含量检测 收集已经培养24 h的Control、H2O2、H2O2+si-NC、H2O2+si-MALAT1细胞，分别用试剂盒检测细胞中SOD和MDA水平，步骤完全按照试剂盒标准流程。

1.6靶基因预测和荧光素酶系统鉴定 使用生物信息学软件(starbase)预测MALAT1靶基因，发现miR-200a与MALAT1有互补结合位点。将MALAT1的互补结合位点突变，并且构建突变型荧光素酶报告载体(MUT)，与miR-200a mimics和mimics control共转染到细胞中，同时构建没有突变的野生型荧光素酶报告载体(WT)与miR-200a mimics和mimics control共转染。培养2 d后，利用荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.7miR-200a inhibitor逆转抑制MALAT1作用 在心肌细胞中共转染MALAT1 siRNA和inhibitor control、MALAT1 siRNA和miR-200a inhibitor，用含有100 μmol/L的H2O2培养液培养，记为H2O2+si-MALAT1+Anti-NC组、H2O2+si-MALAT1+Anti-miR-200a组。按照上述方法测定细胞凋亡和MDA、SOD水平及miR-200a表达变化，步骤同上。

1.8统计分析 采用SPSS21.0统计软件进行独立样本t检验、单因素方差及LSD-t检验。

2 结 果

2.1H2O2诱导心肌细胞中MALAT1表达升高 H2O2处理后心肌细胞中MALAT1水平(1.89±0.13)显著高于Control组(1.00±0.09，t=9.750，P=0.001)，即H2O2诱导心肌细胞中MALAT1表达。

2.2MALAT1 siRNA抑制H2O2条件下心肌细胞中MALAT1表达 心肌细胞转染MALAT1 siRNA后，H2O2+si-MALAT1组MALAT1表达水平(0.45±0.06)明显低于H2O2+si-NC组(1.01±0.12，P<0.05)。

2.3抑制MALAT1减少H2O2诱导的心肌细胞凋亡和氧化损伤 经过H2O2处理的心肌细胞凋亡率升高，MDA含量升高，SOD活性降低。心肌细胞转染MALAT1 siRNA后，经过H2O2处理，细胞凋亡率降低，MDA含量降低，SOD活性升高，见图1，表1。

图1 流式细胞术测定MALAT1 siRNA转染后H2O2处理的心肌细胞凋亡变化

2.4MALAT1靶向调控miR-200a 生物信息学软件发现MALAT1与miR-200a有互补结合位点(图2)。构建MALAT1-WT和MUT荧光素酶报告载体，miR-200a mimics和WT共转染后的细胞荧光素酶活性降低，见表2。

表1 MALAT1 siRNA转染后对H2O2处理心肌细胞凋亡和SOD、MDA的影响

与Control组比较：1)P<0.05；与H2O2+si-NC组比较：2)P<0.05

图2 生物信息学软件预测MALAT1靶向调控miR-200a

表2 荧光素酶活性变化

2.5抑制MALAT1促进H2O2条件下心肌细胞中miR-200a表达 H2O2处理后心肌细胞中miR-200a表达水平(0.63±0.06)显著低于Control组(1.00±0.10，P<0.05)，MALAT1 siRNA转染后的心肌细胞经过H2O2处理，细胞中miR-200a水平(0.96±0.11)显著高于H2O2+si-NC组(0.62±0.05，P<0.05)。

2.6miR-200a inhibitor逆转抑制miR-200a对H2O2条件下心肌细胞凋亡和氧化损伤影响 与共转染MALAT1 siRNA和inhibitor control的细胞比较，在心肌细胞中共转染MALAT1 siRNA和miR-200a inhibitor，经过H2O2处理，细胞中miR-200a水平降低，细胞凋亡率升高，SOD活性降低，MDA含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 MALAT1 siRNA和miR-200a inhibitor转染后对H2O2处理心肌细胞凋亡和SOD、MDA的影响

与H2O2+si-MALAT1+Anti-NC组比较：1)P<0.05

3 讨 论

缺血再灌注、心肌缺血、心脏重塑等与心血管系统疾病有关的心肌损伤过程中均会产生大量的氧自由基，这些氧自由基过度积累与细胞中抗氧化酶SOD活性降低有关，而大量的氧自由基可以诱导心肌细胞发生氧化损伤，诱导细胞凋亡发生〔9，10〕。H2O2是常见的体外诱导心肌细胞氧化应激的诱导因子，其能够促进细胞中脂质发生过氧化，生成MDA，造成氧化损伤〔11〕。本实验发现，H2O2处理后的心肌细胞凋亡率升高，细胞中MDA含量升高，SOD活性降低，说明成功构建了氧化应激诱导的心肌细胞损伤模型。

MALAT1又称为NEAT2，其编码基因定位在11q13.1染色体上，是基因之间的转录本，其在哺乳动物体内具有高度保守性，在生物进化过程中发挥关键作用〔12〕。MALAT1功能十分广泛，具有调控细胞生长、表观遗传、氧化应激等作用〔13〕。以往研究显示，MALAT1在正常细胞损伤时表达上调，下调MALAT1抑制细胞损伤发生〔14〕。在心肌细胞中的研究报道表明，MALAT1在受到白细胞介素(IL)-6、LPS等刺激后的细胞中表达异常升高，且抑制其表达能够明显下调心肌细胞凋亡水平，减少细胞损伤〔15〕。这些研究结果可能提示，MALAT1在细胞损伤过程中发挥促进作用。本实验发现，H2O2处理后的心肌细胞中MALAT1表达水平升高，抑制MALAT1可以降低H2O2诱导的心肌细胞凋亡和MDA合成，提高细胞中SOD活性，说明下调MALAT1具有保护心肌细胞氧化损伤的作用，靶向抑制MALAT1可能是减轻心肌细胞氧化损伤的途径。

目前对于MALAT1的调控机制发现，其可以靶向调控miRNA的表达发挥生物学作用，并且其靶基因有多个，在不同的组织和生理过程中靶向调控机制可能不同〔16〕。目前已知MALAT1靶基因有miR-205、miR-570-3p、miR-23c等〔17～19〕。本实验发现，MALAT1与miR-200a有互补结合位点，并且miR-200a受到MALAT1的负调控作用。以往研究表明，miR-200a在心肌损伤中表达下调，且miR-200a能够缓解心肌损伤程度〔20〕。本实验发现，H2O2诱导心肌细胞中miR-200a表达下降，并且下调miR-200a可以逆转抑制MALAT1对心肌细胞的保护作用，说明抑制MALAT1通过靶向上调miR-200a表达抑制心肌细胞氧化损伤。

总之，MALAT1在心肌损伤中可能发挥促进作用，靶向抑制MALAT1表达通过上调miR-200a降低心肌细胞氧化损伤，减少细胞凋亡，MALAT1可能是减轻心肌损伤的有效途径。