miR-381通过下调SETDB1抑制结肠癌细胞转移

满艳 褚静

(1枣庄学院校医院消化科，山东 枣庄 277160；2枣庄市中医医院消化科)

结肠癌是我国近年来发病率升高较快的消化系统肿瘤之一〔1〕。结肠癌患者早期多以纳差、体重减轻及排便习惯改变等亚临床表现为主，大多数患者就诊时已处于疾病中后期而丧失了获得良好预后的机会〔2〕。因而研究结肠癌新的诊断标志物及分子治疗策略对提高结肠癌患者手术切除率及改善患者长期预后具有重要作用。

微小RNA(miRNA)是一类长度在25个碱基以内的单链RNA〔3〕。在结肠癌中已发现许多与细胞增殖〔4〕、转移〔5〕及血管生成〔6〕密切相关的miRNA。miR-381是近年来新鉴定的出的一种miRNA，它在胃癌〔7〕、肝癌〔8〕及乳腺癌〔9〕中的表达水平显著下调并能抑制肿瘤细胞生长及侵袭，提示miR-381是一种潜在的抑癌基因。目前，miR-381在结肠癌中的表达变化、临床意义及生物学功能均尚不完全清楚。本研究通过检测miR-381在结肠癌中的表达情况；利用人工合成的miR-381模拟物特异性上调结肠癌SW480细胞中miR-381的表达水平，探究上调miR-381基因表达在体外对结肠癌细胞迁移及侵袭能力的影响。旨在为miR-381成为抑制结肠癌转移的分子治疗靶点提供一定的实验依据。

1 材料和方法

1.1组织标本 选取2013年1月至2016年10月于枣庄市中医医院消化科收治并行手术切除的50例结肠癌及对应癌旁组织(距肿瘤边缘距离>2 cm)标本。所有标本于离体半小时内取材，分两份于4%多聚甲醛及液氮中固定保存。

1.2细胞来源及主要试剂 SW480细胞由消化科实验室保存；miR-381模拟物(mimics)、阴性对照模拟物 (control mimics)、miR-381茎环引物试剂盒(含内参RNU6B)均购自广州锐博基因公司；DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司；Trizol RNA提取试剂、Lipofectamine 3000转染试剂盒、RT-PCR试剂盒及qPCR试剂盒均购自美国Invitrogen公司；Transwell小室购自美国康宁公司；基质胶购自美国B&D公司；免疫组化Sp法试剂盒购自北京中杉金桥生物科技有限公司。组蛋白赖氨酸N端甲基转移酶SET结构域分支型(SETDB)1及GAPDH抗体由Santa Cruz公司提供。SETDB1引物(上游5′-GGGCAAGGGTGTTTTCATTAAC-3′；下游5′-GTTAGTTGATGGCAGGCACACTT-3′)及GAPDH引物(上游5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′；下游5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′)由上海生工生物有限公司合成。

1.3qRT-PCR 通过Trizol试剂提取标本及细胞RNA，配制逆转录及PCR扩增体系。设置反转录条件：50℃ 30 min，94℃ 2 min，循环次数1；94℃ 15 s，60℃ 30 s，68℃ 3 min，循环次数40；72℃ 10 min。通过2-△△Ct法检测miR-381及SETDB1 mRNA的相对含量。

1.4细胞培养及转染 SW480细胞于适宜环境中培养，稳定传代2～3代后进行实验。将SW480细胞按过夜增殖至愈合度达70%的密度接种6孔细胞培养板。达到预定培养密度后移除培养基，1×磷酸盐缓冲液(PBS)溶液充分洗涤细胞。转染分组：miR-381组每孔加入100 pmol miR-381 mimics、5 μl Lipofectamine 3000转染试剂及2 ml无血清DMEM培养基；miR-control组每孔加入100 pmol control mimics、5 μl Lipofectamine 3000转染试剂及2 ml无血清DMEM培养基。转染24 h后更换完全培养基继续培养。

1.5划痕愈合试验 SW480细胞接种于6孔板中，接种密度以过夜铺满为准。无血清DMEM培养基饥饿细胞12 h以削弱细胞黏附作用。100 μl的移液器枪头由每孔中线划过，PBS清洗6孔板内残余悬浮细胞，每孔加入2 ml无血清DMEM培养基。培养48 h后在显微镜下观察细胞迁移情况并拍照。

1.6Transwell侵袭小室 用1×DMEM按8∶1稀释50 mg/L的基质胶，按100 μl每孔包被Transwell小室底膜上室面，4℃风干后放入24孔板内。收集转染后的SW480细胞，以无血清DMEM培养基重悬后调整细胞密度为1×105/ml，按250 μl每孔接种于Transwell小室上室中，24孔板内每孔加入750 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基。培养箱内培养24 h后弃去上室内培养基，PBS洗涤2遍后采用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，棉棒擦去上室面残余细胞，在200倍显微镜下观察下室面细胞并计数。

1.7Western印迹法 RIPA试剂提取细胞总蛋白，电泳、转膜后用5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1 h；用3%浓度的脱脂奶粉溶液按1∶1 000比例稀释的SETDB1及GAPDH抗体。在4℃下孵育相应条带过夜。洗去残余一抗后采用1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔或抗鼠二抗室温孵育条带1 h。于暗室内，电化学发光(ECL)法观察蛋白表达。

1.8免疫组化 多聚甲醛固定、石蜡包埋的结肠癌及癌旁标本组织切片常规进行脱蜡及水化预处理；用抗体稀释液按1∶100比例稀释兔抗人SETDB1多克隆抗体，滴加抗体于组织切片上并充分浸没组织标本；4℃恒温冰箱内孵育过夜，洗净未结合一抗后，使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗结合相应一抗，二氨基联苯胺(DAB)法显示阳性蛋白。400倍视野下每张组织切片下随机选取10个视野按文献〔10〕所述方法进行免疫组化评分。

1.9统计学处理 应用SPSS13.0进行χ2检验及t检验。

2 结 果

2.1miR-381在结肠癌组织中的表达及临床意义 50例结肠癌组织中miR-381的表达水平(0.627±0.054)显著低于对应癌旁组织(1.361±0.048)，差异具有统计学意义(t=10.080，P<0.001)。通过分析50例结肠癌患者的临床病理特征表明，具有淋巴结转移的结肠癌患者的miR-381表达量(0.457±0.052)比无转移患者(0.750±0.079)更低(t=2.855，P=0.006)。提示miR-381对肿瘤转移有一定调节作用。

2.2miR-381抑制SW480细胞迁移及侵袭 PCR结果显示，转染miR-381 mimics的细胞内miR-381表达水平较miR-control组显著升高(45.378±3.087 vs 1.000±0.000，t=16.564，P<0.001)。划痕愈合试验结果表明，与miR-control组比较，miR-381组显著降低了SW480细胞的迁移能力(73.842±6.793 vs 19.840±5.550，t=4.223，P=0.027)，见图1；transwell侵袭小室模型检测结果表明，miR-381组(11.702±4.327)显著少于miR-control组侵袭细胞数目(33.103±5.292)，差异具有统计学意义(t=3.651，P=0.033)，见图2。

2.3miR-381抑制SW480细胞中SETDB1的表达 为研究miR-381在结肠癌细胞中的作用机制，本研究通过生物信息学检索发现SETDB1可能是miR-381的潜在作用靶点之一。见图3。为验证这一推测，本研究通过qPCR和蛋白免疫印迹检测了过表达miR-381后SW480细胞内SETDB1表达的变化。结果表明，与miR-Control组相比，miR-381组SW480细胞内SETDB1 mRNA(1.000±0.000 vs 0.408±0.082，t=10.521，P=0.008)及蛋白(0.881±0.137 vs 0.315±0.056，t=4.786，P=0.027)水平均显著降低。SETDB1下游靶基因基质金属蛋白酶(MMP)-2蛋白的表达也明显下调(0.331±0.034 vs 0.114±0.021，t=3.472，P=0.036)。见图4、图5。

2.4SETDB1在肝癌中的表达及与miR-381的表达相关性 结肠癌组织中SETDB1的表达水平较癌旁组织显著升高(9.064±1.045 vs 3.117±0.521，t=5.272，P=0.011)；Pearson相关性分析表明SETDB1与miR-381的表达呈负相关关系(r=-0.325，P=0.021)。进一步证明了miR-381对SETDB1的调控作用。见图6、图7。

图1 两组不同时间SW480细胞迁移能力比较(×200)

图2 两组SW480细胞侵袭数目比较(×200)

图3 miR-381与靶基因SETDB1的互补关系

图4 Western印迹检测SETDB1蛋白表达

图5 Western印迹检测MMP-2蛋白表达

图6 SETDB1与miR-381的相关性

图7 结肠癌组织与癌旁组织SETDB1表达(×400)

3 讨 论

miR-381在不同类型的恶性肿瘤中的表达趋势并不统一〔11〕。本研究通过qPCR检测发现，miR-381在结肠癌组织中的表达水平要低于癌旁组织，说明在miR-381在结肠癌中可能是一种抑癌因子。同时，有淋巴结转移的结肠癌组织中miR-381的表达量要更低，因此miR-381可能抑制肿瘤的转移。为验证这一假设，本研究设计了一系列体外细胞学实验证实，miR-381在体外培养环境中均具有一定的抑制肿瘤细胞侵袭转移的作用。有研究也指出，miR-381也能够抑制肿瘤细胞的增殖并促进细胞凋亡而降低肿瘤的生长能力〔12〕。说明miR-381的抗肿瘤效应具有生物多样性，值得今后的工作中进一步深入研究。

miRNA能够通过结合靶基因3′-UTR区而发挥负向调控作用。通过生物信息学检索分析发现，SETDB1 mRNA存在miR-381的结合位点。既往研究〔13〕也表明SETDB1在结肠癌内高表达且具有促癌作用，其可能是miR-381的潜在靶点之一。通过PCR及蛋白印迹试验发现，过表达miR-381在体外的确能下调SETDB1的表达水平。在多种疾病模型中的研究结果表明SETDB1能够调节包括Wnt/β-catenin在内的多条信号通路而影响细胞的生物学特性〔14〕。研究表明，与肿瘤细胞侵袭转移相关的MMP-2也是SETDB1的下游效应分子之一〔15〕。本研究中，过表达miR-381后，在下调SETDB1表达水平的同时MMP-2的表达水平也受到抑制，提示miR-381的抑制肿瘤转移的作用最终可能是通过下调MMP-2的表达而实现的。

综上所述，miR-381在结肠癌中低表达，上调miR-381可能通过抑制SETDB1/MMP-2的表达而抑制结肠癌转移。