金银花提取物对重症急性胰腺炎肺损伤大鼠ROS-NLRP3炎症小体信号通路的影响*

阮辉辉 卫 巍 许永富

（上海市第十人民医院，上海 201106）

急性胰腺炎属于腹部急性炎症反应疾病，而重症急性胰腺炎（SAP）病情严重，致死率高，不仅表现为胰腺缺血、坏死，且合并全身多出器官损伤，其中肺损伤为SAP常见的并发症，是导致SAP患者死亡的重要的原因［1］。有资料显示，核苷酸结合域样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体通路在受到ROS激活后促进炎性反应，加重组织损伤，进而而参与肺损伤的发病机制［2］，推测ROS-NLRP3炎性体通路可能在SAP肺损伤中发挥重要作用。金银花属于忍冬科植物，具有广泛的药理作用，如清热解毒、抗盐、抗氧化、抗肿瘤、降压等，为多种中药制剂的主要成分，对肺部炎症疾病具有一定的治疗效果［3-4］，然而在SAP合并肺损伤中的作用，目前尚不清楚。本研究采用自制金银花水提取液（HFE）对SAP肺损伤大鼠进行治疗，探究其对SAP大鼠肺组织的改善，探讨可能机制，以期为疾病的治疗提供一定的参考。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SPF级成年SD大鼠，8周龄，雄性，体质量220～240 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号为SYXK（京）2017-0033，所有大鼠均置于统一环境饲养，饲养温度为23～25℃，湿度为50%～60%，严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》进行饲养。本研究经本院动物伦理委员会批准，审批号：IACUC20170328。

1.2 试药与仪器 金银花购于张仲景大药房，置于50℃烘箱中烘干2 h，于研磨机中研磨成粉，称取100 g，于1 L 50%乙醇中浸泡24 h，过滤后滤渣添加1 L 50%乙醇60℃浸泡3 h，收集滤液，在旋转蒸发仪中（65℃）浓缩，添加蒸馏水定容至100 mL，即为原药液，浓度为1 g/mL；地塞米松购于广西万德药业股份有限公司，批号170314；牛磺胆酸钠（货号145-42-6）购于上海紫一试剂厂；HE染色试剂盒（货号C0105）购于碧云天生物技术研究所；白细胞介素-1β（IL-1β）（货号hz-0011c）、白介素-18（IL-18）（货号h-0253c）检测试剂盒购于上海沪震实业有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）（货号A001-3）、丙二醛（MDA）（货号A003-1）检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；鼠抗NLRP3（货号15101）购于美国CST公司；凋亡相关斑点样蛋白（ASC）（货号AF3805-SP）、半胱天冬酶（Caspase-1）（货号MAB601-SP）、IL-1β（AF6215-SP）抗体购于美国R&D公司；HRP标记IgG二抗（货号sc-51642）购于美国SantaCruz公司；80I显微镜购于日本Nikon公司。

1.3 分组与造模 参照文献制备SAP大鼠［5］，随机挑选80只大鼠，禁食不禁水12 h后，腹腔注射3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）充分麻醉大鼠，于腹正中切开，暴露十二指肠，区分胰胆管以及肝门部胆管，于近肝门端、近肠端胰胆管用动脉夹夹闭，用注射器针头穿刺胰管，缓慢推注5%牛磺胆酸钠溶液，注射量为1.5 mL/kg，注射速率为0.2 mL/kg，10 min后，除去动脉夹，当胰腺组织出现水肿并伴有出血［6］，表明SAP模型制备成功，随后退出针头，按摩穿刺孔，用封闭胶将穿刺孔封闭后，复位肠管逐层关腹。假手术组大鼠（16只）仅翻动肠管。造模后将大鼠分为模型组及HFE低、中、高剂量组、地塞米松组，每组16只大鼠。

1.4 给药方法 金银花提取物组：造模后尾静脉注射金银花提取液，参考文献［7］注射剂量分别为40、80、120 mg/kg；地塞米松组：造模后尾静脉注射地塞米松溶液，参考文献［7］注射剂量为0.5 mg/kg。假手术组、模型组尾静脉注射等量0.9%氯化钠注射液；各组大鼠均连续给药4周。

1.5 标本采集与检测 1）样本收集。末次给药后各组选取6只大鼠麻醉后，迅速于左肺进行支气管肺泡灌洗，收集支气管肺泡灌洗液（BALF），重复3次，置于-20℃保存。采集各组剩余大鼠腹主动脉血2 mL，离心后于-20℃保存上清；处死大鼠获得左肺叶组织、胰腺组织，进行组织湿/干质量比分析，随后一部分肺组织置于4%多聚甲醛中固定，一部分冻存-80℃。胰腺、肺组织湿重、干重测定。2）组织形态学检测。常规制备4 μm胰腺、肺组织石蜡切片，经脱蜡、脱水后，采用HE染色试剂盒对切片进行染色，于显微镜下观察组织病理学变化，参考Schimidit半定量评分系统对胰腺组织病理学情况进行评定打分［9］。3）动脉血气指标检测。利用全自动血气分析检测仪对腹动脉血中氧分压、二氧化碳分压进行检测。4）BALF中炎性细胞及因子水平检测。参考试剂盒检测说明书进行操作。采用血细胞计数仪对BALF沉淀细胞中总细胞数量和多形核白细胞数量进行计数检测。5）肺组织中SOD、MDA、ROS水平。具体参照SOD、MDA检测试剂盒说明书进行操作。根据文献中二氢乙啶（DHE）法检测肺组织中的ROS相对水平，在荧光显微镜下分析氧化的DHE活性［11］。6）免疫印迹法检测肺组织中NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表达。7）大鼠生存状态评估。参考Zealongals标准对各组大鼠生存状态进行评定并打分［8］。

1.6 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（）描述，两组间比较行t检验，多组间比较行单因素方差分析，进一步两两对比采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 各组大鼠生存情况比较 见表1。与假手术组相比，模型组生存状况评分显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，HFE各组以及地塞米松组生存状况评分均显著升高，呈剂量依赖性（P＜0.05）。各组大鼠死亡率相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠生存情况比较

2.2 各组大鼠胰腺、肺组织形态学情况比较 见图1～图2，表2。椵手术组胰腺组织、细胞形态正常；模型组胰腺组织中细胞发生变性和收缩、空泡样改变，同时伴有炎性细胞浸润（黑色箭头）。HFE各剂量组以及地塞米松组细胞变性、肿胀减少、空泡变小，胰腺组织逐渐恢复。假手术组肺泡结构完整，肺组织为发生水肿、炎性细胞浸润；模型组肺泡壁增厚、肺间质水肿、间隔变宽，伴随大量炎性细胞浸润。HFE各剂量组以及地塞米松组肺组织得到明显改善，且随着给药浓度的升高，肺组织逐渐恢复正常。与假手术组相比，模型组胰腺、肺组织病理评分显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，HFE各剂量组以及地塞米松组胰腺、肺组织病理评分均显著降低，呈剂量依赖性（P＜0.05）。

图1 胰腺组织形态学变化（HE染色，100倍）

图2 肺组织形态学变化（HE染色，100倍）

表2 各组大鼠胰腺组织、肺组织病理评分比较（分，±s）

表2 各组大鼠胰腺组织、肺组织病理评分比较（分，±s）

组别假手术组模型组HFE低剂量组HFE中剂量组HFE高剂量组地塞米松组n 10 10 10 10 10 10肺组织病理评分0.38±0.06 3.51±0.16*2.74±0.25*△2.16±0.36*△1.08±0.28*△0.94±0.19*△胰腺组织病理评分0.57±0.15 7.28±0.65*6.17±0.53*△4.25±0.49*△2.14±0.34*△1.94±0.28*△

表3 各组大鼠动脉血气压、组织干湿重比较（±s）

表3 各组大鼠动脉血气压、组织干湿重比较（±s）

组 别n 血氧分压（mmHg） 二氧化碳分压（mmHg） 胰腺组织（W/D） 肺组织（W/D）假手术组模型组HFE低剂量组HFE中剂量组HFE高剂量组地塞米松组10 10 10 10 10 10 95.64±2.63 56.42±3.47*66.24±2.62*△70.82±2.48*△76.49±2.69*△78.16±2.71*△32.67±3.62 58.66±4.35*47.45±3.71*△42.17±3.59*△39.64±3.68*△38.65±3.14*△2.38±0.39 4.57±0.43*3.49±0.36*△3.13±0.48*△2.87±0.37*△2.75±0.32*△2.65±0.29 4.84±0.31*4.17±0.24*△3.94±0.28*△3.43±0.20*△3.37±0.24*△

2.3 各组大鼠动脉血气压、组织干湿重比较 见表3。与假手术组相比，模型组二氧化碳分压、胰腺、肺组织W/D显著升高，血氧分压显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，HFE各剂量组以及地塞米松组二氧化碳分压、胰腺、肺组织W/D显著降低，血氧分压显著升高，呈剂量依赖性（P＜0.05）。2.4 各组大鼠BALF中炎性因子比较 见表4。与假手术组比较，模型组BALF中IL-1β、IL-18、总细胞数量、多形核白细胞数量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，HFE各剂量组以及地塞米松组BALF中IL-1β、IL-18、总细胞数量、多形核白细胞数量显著降低，呈剂量依赖性（P＜0.05）。

表4 各组大鼠BALF中炎性因子水平比较（±s）

表4 各组大鼠BALF中炎性因子水平比较（±s）

组别假手术组模型组HFE低剂量组HFE中剂量组HFE高剂量组地塞米松组n 6 6 6 6 6 6 IL-1β（pg/mL）28.03±2.05 175.74±22.46 136.25±17.34 103.53±14.59 87.39±11.65 79.16±8.71 IL-18（pg/mL）22.34±3.11 219.28±30.65 172.47±18.32 143.62±25.44 128.56±19.07 115.65±3.14总细胞数量（×105）1.01±0.01 14.59±2.69 8.34±1.23 7.05±1.41 6.57±1.17 6.25±0.32多形核白细胞数量（×105）0.06±0.01 12.35±2.16 7.73±1.53 6.26±2.11 5.96±1.68 5.37±0.24

2.5 各组肺组织SOD、MDA水平比较 见表5。与假手术组比较，模型组肺组织SOD水平显著降低，MDA水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，HFE各剂量组以及地塞米松组肺组织SOD水平显著升高，MDA水平显著降低，呈剂量依赖性（P＜0.05）。

表5 各组大鼠肺组织SOD、MDA水平比较（±s）

表5 各组大鼠肺组织SOD、MDA水平比较（±s）

组别假手术组模型组HFE低剂量组HFE中剂量组HFE高剂量组地塞米松组n 10 10 10 10 10 10 SOD（U/mg）37.95±2.18 20.27±1.29*25.81±1.17*△28.56±1.19*△29.18±1.55*△29.79±1.64*△MDA（μmol/g）133.27±13.66 200.75±16.38*181.69±15.44*△166.33±13.85*△152.49±14.79*△148.63±16.49*△

2.6 各组大鼠肺组织中ROS、NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1水平比较 见表6，图3。各组大鼠肺组织ROS水平比较：与假手术组相比，模型组大鼠肺组织中ROS显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，HFE各剂量组以及地塞米松组肺组织中ROS显著降低（P＜0.05）。各组大鼠肺组织中NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1表达情况：与假手术组相比，模型组大鼠肺组织中NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表达显著增加（P＜0.05）；与模型组相比，HFE各剂量组以及地塞米松组肺组织中NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表达显著降低（P＜0.05）。

表6 各组大鼠肺组织NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白及ROS表达量比较（±s）

表6 各组大鼠肺组织NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白及ROS表达量比较（±s）

组别假手术组模型组HFE低剂量组HFE中剂量组HFE高剂量组地塞米松组n 10 10 10 10 10 10 NLRP3 0.17±0.06 1.26±0.16*1.02±0.14*△0.92±0.12*△0.76±0.08*△0.62±0.03*△ASC 0.19±0.02 0.94±0.11*0.81±0.11*△0.68±0.08*△0.42±0.05*△0.39±0.04*△IL-1β 0.22±0.03 0.85±0.09*0.72±0.07*△0.68±0.08*△0.58±0.06*△0.42±0.03*△Caspase-1 0.26±0.05 0.88±0.06*0.57±0.07*△0.41±0.09*△0.36±0.07*△0.32±0.05*△ROS 1.00 4.62±0.57*3.71±0.63*△2.67±0.49*△2.14±0.61*△2.06±0.53*△

图3 免疫印迹法检测肺组织中NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表达

3讨 论

本研究采用逆行胆管注射牛磺胆酸钠制备SAP模型，结果发现模型组胰腺组织中细胞发生变性和收缩、空泡样改变，胰腺泡破坏，同时伴有炎性细胞浸润，胰腺W/D比值增大，表明胰腺水肿，与临床水肿型胰腺炎病理特征相似［12］，提示SP大鼠制备成功。进一步对肺部检测发现肺泡壁增厚、肺间质水肿、间隔变宽，伴随大量炎性细胞浸润，肺W/D比值、大鼠动脉血二氧化碳分压升高，氧分压降低，大鼠肺BLAF中总细胞数和多形核白细胞数量显著升高，表明SAP不仅引起大鼠胰腺组织损伤，且可诱发大鼠肺水肿及组织损伤，提示SAP肺损伤模型制备成功。

药理研究显示金银花具有抗病毒、解热、抗内毒素、抑菌、抗炎等功效，对肺炎具有一等的治疗作用［13-14］。本研究发现与模型组相比，HFE各剂量组胰腺组织、肺组织病理学评分均显著降低，胰腺、肺W/D比值降低，氧分压升高，二氧化碳分压降低，大鼠肺BLAF中总细胞数和多形核白细胞数量显著，呈剂量依赖性，其高剂量组与Dex组效果相似，提示HFE能够改善SAP引发的肺组织损伤，降低组织炎性反应，然而具体机制目前尚不清楚。

肺泡巨噬细胞产生大量IL-18、IL-1β等促炎性细胞因子，引发肺部炎症反应［15］。肺损伤大鼠研究中发现，给予IL-1β抗体治疗可显著降低炎症反应，缓解肺损伤［16］。国内研究发现，IL-1β炎性细胞因子上调可促进肺组织中性粒细胞浸润，加重炎症损伤［17］。本研究发现，模型组大鼠BALF中IL-18、IL-1β、总细胞数、多形核白细胞数量显著升高，提示SAP大鼠肺组织炎性损伤；给予金银花提取液干预后IL-18、IL-1β、总细胞数和多形核白细胞数量降低，提示HFE可能通过抑制肺组织炎性细胞浸润，降低炎症因子水平从而缓解肺组织损伤。

氧化应激反应为肺损伤的重要病理机制，急性胰腺炎相关性肺损伤动物模型中发现小鼠肺组织中氧化应激水平较高，同时伴有炎性细胞浸润［18］。此外肺损伤后组织中SOD抗氧化因子水平异常导致氧自由基、MDA水平升高，造成氧化应激反应升高损伤肺组织［19］。本研究发现模型组肺组织中SOD水平降低，MDA水平升高，给予HFE干预后SOD水平升高，SOD水平降低，提示HFE可能通过抑制肺组织氧化应激反应减轻肺组织损伤。

近来研究发现，NLRP3炎性小体参与肺损伤的发生发展［20］。NLRP3为NLRP3炎性小体通路的核心蛋白，研究显示在多种外源性和内源性危险信号刺激下激活NALP3炎性小体，可改变NALP3结构，ATP作用下形成NALP3蛋白复合体，促进ASC、Caspase-1集合，激活pro-Caspase-1向Caspase-1分裂，进而促进IL-1β成熟并分泌细胞外引发炎症反应［21-22］。本研究发现，HFE能够抑制大鼠肺组织中NLRP3、Caspase-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的表达，推测HFE可能是通过抑制肺组织NLRP3炎症小体活化，进而抑制Caspase-1的成熟、IL-1β分泌，发挥抗炎作用，进而改善肺组织损伤。肺组织中ROS等激活剂的产生可激活NLRP3炎症小体，因此ROS常作为NLRP3炎症小体激活剂调节NLRP3的表达［23］。本研究中Model大鼠肺组织中ROS水平显著升高，给予HFE干预后，ROS水平降低，结合过往研究推测，HFE可能通过抑制肺组织氧化应激反应，进而抑制NLRP3炎症小体的活化。

综上所述，HFE对SAP大鼠肺损伤具有保护作用，且这种作用可能通过抑制ROS产生，进而抑制NLRP3炎症通路介导的促炎因子IL-1β和IL-18的分泌，缓解肺组织炎症损伤。然而HFE仅能缓解大鼠肺组织损伤，并不能逆转肺组织损伤，可能与药物剂量有关，也有可能与SAP肺损伤其他作用机制有关，这还有待后续深入研究。