氧化石墨烯对盐胁迫下树莓组培苗生长及生理特征的影响

薛斌龙，胡晓飞，姚建忠，王海雁，赵建国

（1.山西省桑干河杨树丰产林实验局科技服务中心，山西 大同 037000；2.太原理工大学材料学院，山西 太原 030000；3.山西大同大学化工学院炭材料研究所，山西 大同037000）

土壤盐碱化问题日益威胁着人类赖以生存的有限土地资源。盐碱地是限制植物产量和区域分布的最主要因素之一。石墨烯具有独特的二维结构和优异的力学性能、热学性能和电学性能、电化学性能、大比表面积和高透明度等特殊的理化特性[1]，氧化石墨烯是石墨烯的氧化形式。其表面具有丰富的官能团，能够使原本惰性的碳层变得活泼,为各种反应的发生提供了大量表面活性位点,提升吸附、催化等化学反应中的活性[2]。氧化石墨烯的独特结构及优异性质,在吸附、催化、能储、过滤、传感、脱盐等众多领域得到广泛应用[3]。但氧化石墨烯生物效应的研究还相对较少，在林业领域应用的研究尚处于起步阶段，至今还未有专门针对其在苗木抗逆性方面影响的研究。

利用整体植物组织研究实验室内培养条件下的盐胁迫响应技术在植物中已得到应用。植物的早期生长是植物对盐离子响应最敏感的阶段，相对于器官、组织、细胞等外植体，整体植物研究可提供更多的研究信息[4]。树莓(Rubus corchorifoliuslf)是蔷薇科悬钩子属果树，多年生落叶小灌木。树莓酸甜可口，营养丰富，有浓郁的芳香，具有较高的经济价值。树莓适应性广，长势强，对土质无特殊要求，并且可以快速治理荒山，是生态效益、经济效益极高的小灌木果树品种。

此次研究以树莓组培苗为试验材料，研究了在组培条件下，氧化石墨烯对树莓组培苗耐盐能力的影响。以期为逆境条件下氧化石墨烯对林木抗逆性影响提供理论基础和技术指导，也对促进氧化石墨烯在盐碱化地区推广应用，加快盐碱地植被恢复具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采用山西省杨树局科技中心组培室保存的树莓组培苗作为植物材料。树莓生根培养基使用（1/2MS+0.05 mg·L-1IBA+琼脂 6g·L-1+糖 28g·L-1PH 值5.8～6.0）。培养室的培养条件为:温度(25±2)℃;光周期为 14h·d-1。

1.2 试验方法

1.2.1 NaCl胁迫处理

实验共设4种处理:(1)对照CK,在生根培养基中不加NaCl和GO;(2)NaCl胁迫,在生根培养基中加入 75mmol·L-1NaCl;(3)NaCl胁迫+GO,在生根培养基中加 75mmol·L-1NaCl和 0.05mg·L-1GO。(4)NaCl胁迫+2mg·L-1GO,在生根培养基中加 75mmol·L-1NaCl和2mg·L-1GO。NaCl和GO在制备基本培养基(MS)时分别加入。除琼脂为化学纯外,其他所用化学试剂均为分析纯。选取增殖培养健壮且生长一致的组培苗为材料,切割成带一个腋芽的茎段,转接至生根培养基进行生根培养试验。单株处理(包括对照)分别接种20瓶，3次重复。

1.2.2 树莓形态学研究和抗氧化酶活性的测定

NaCl胁迫各处理接种后培养35d胁迫处理之后，记录根系状况、植株状况。采用LA-S植物图像分析仪系统对生根组培苗的根系进行量化分析。

用于分析植株抗氧化酶活性的材料均为全株,取新鲜样品,立即放入液氮中冷冻,保存于?80℃冰柜中。用于测定蛋白含量，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶（Catalase CAT）和过氧化物酶(peroxidase，POD)活性。各项生理生化指标均重复测试3次，测定方法参照南京建成公司的相关试剂盒说明书进行。

1.2.3 NaCl胁迫各处理培养基电导率的变化

Nacl胁迫4种处理（不加琼脂）各1升，静置冷却至室温，关闭周围可产生影响性能振动和电磁干扰的设备。雷磁DDSJ-308F型电导率仪平行测定6次。

查阅说明书，电导率仪根据所测培养基电导率范围为 0-20mS·cm-1，按说明书所述，配制 0.1mol·L-1和0.01mol·L-1的KCl溶液进行标定。标定后的电导率仪测相应校准液，检验结果是否与标准值一致。

1.2.4 数据分析

采用用EXCEL2003对数据进行前期处理，SPSS17.0、Origin 8.5软件进行数据统计分析。多重比较采用Duncan氏新复极差法，显著性水平为P＜0.05，数据均以平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 GO对NaCl胁迫下树莓组培苗生根培养效果的影响

由图1可见，与对照相比,在含75mmol·L-1NaCl的生根培养基上培养35d,树莓组培苗的株高显著减小,减幅达 35.42%（P＜0.01），对根系的形成和生长的抑制作用明显，总根长减幅达29.24%（P＜0.01），根尖数、根系表面积、根系体积减幅分别达40.55%（P＜0.01）、26.67%（P＜0.01）、21.06%，4 项指标均有显著差异，而根系平均直径加粗11.75%。

Nacl胁迫下加0.05mg·L-1GO处理与单纯Nacl胁迫处理相比，株高与根系总根长并未有明显改变，而根系直径略微变细。根数增加28.33%，根系表面积和根系体积分别减少20.35%、40.88%。Nacl胁迫下加2mg·L-1GO处理与单纯Nacl胁迫处理相比,株高并没有显著变化，但生根情况明显好转。植株总根长、根数、根系表面积、根系体积均有显著差异，分别增加 84.5%（P＜0.01）、119.89%（P＜0.01）、125.25%（P＜0.01）、152.63%（P＜0.01）。

由图2可见，与对照相比,在含75mmol·L-1NaCl的生根培养基上培养35d,树莓组培苗的形态发生明显变化，植株叶量减少，株高降低，根系发育差。Nacl胁迫下加入2mg·L-1GO处理，植株叶量增加，生根效果好转。

这些结果表明，添加适当浓度的GO可减轻盐胁迫对植株的伤害，促进植株在盐胁迫环境下根系的发育和植株生长。

图1 GO对NaCl胁迫下树莓组培苗生根培养效果的影响Figure1 Effect of GO on Rooting Culture of tissue culture seedlings of Rubus corchorifolius under NaCl Stress/mg·L-1图中数据为平均值±标准误差;同一组数据后小写字母不同者，表示差异达显著水平（P<0.05）

图2 GO对NaCl胁迫下树莓组培苗形态的影响Figure2 Effects of GO on morphology of tissue culture seedlings of Rubus corchorifolius under NaCl Stress/mg·L-1

2.2 GO对NaCl胁迫下树莓组培苗抗氧化酶活性的影响

盐碱环境胁迫下，植物体由于细胞内活性氧（ROS）的产生增多，引发了活性氧的代谢紊乱，对细胞造成一系列的毒害[5]。ROS包括氧离子、过氧化物和含氧自由基等,存在未配对的自由电子，十分活跃。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，能够把02-·歧化生成H2O和O2。POD和CAT的反应底物都是H2O2，能够清除植物体内产生的H2O2，在抑制植物膜脂过氧化方面发挥着重要作用。SOD，POD，CAT是植物保护酶系统的成员，在盐逆境中各自活性变化不完全相同。

图3 GO对NaCl胁迫下树莓组培苗根系中SOD、POD、CAT活性及蛋白含量的影响Figure3 Effects of GO on the activity of three protective enzymes SOD、POD、CATand protein contents in root of tissue culture seedlings of Rubus corchorifolius plantlets under NaCl stress/mg·L-1

图4 GO对NaCl胁迫下树莓组培苗茎中保护酶活性及蛋白含量的影响Figure4 Effects of GO on the activity of three protective enzymes and protein contents in steam of of tissue culture seedlings of Rubus corchorifolius plantlets under NaCl stress/mg·L-1

由图3可见，在本实验中与对照相比,含75mmol·L-1NaCl的生根培养基上培养35d,根系中SOD和CAT两种抗氧化酶活性均显著下降，分别为44.16%和27.31%（P＜0.01），仅根系中POD活性显著提高13.02%（P＜0.05）。Nacl胁迫下加入不同浓度GO处理与单独Nacl胁迫处理相比，根系中三种抗氧化酶活性均显著降低，两种浓度仅仅在CAT活性方面表现略有不同。而根系中总蛋白含量显著升高，两种浓度无差异。

由图4可见，在本实验中，与对照相比,在含75mmol·L-1NaCl的生根培养基上培养35d,茎段中POD、SOD抗氧化酶活性显著下降，分别达21.61%和37.79%（P＜0.01）。茎段中蛋白含量显著上升达54.14%（P＜0.01）。Nacl胁迫下加入不同浓度GO处理与单独Nacl胁迫处理相比，茎段中POD与SOD活性显著升高，其中加入2mg·L-1GO处理与单纯Nacl胁迫处理相比POD与SOD抗氧化酶活性分别提高94.704%与70.304%（P＜0.01）。各处理茎段中未测到CAT保护酶。

总之，在盐胁迫下树莓根系生长受到抑制，根系通过提高POD酶活性来清除H2O2，而植株茎段中POD、SOD抗氧化酶活性显著降低。两种GO的添加使根系和茎段中3种抗氧化酶活性出现显著变化。

2.3 NaCl胁迫各处理培养基电导率的变化

图5 GO对NaCL胁迫下树莓生根培养基电导率的影响Figure5 Effect of GO on electrical conductivity of Rubus corchorifolius rooting medium under NaCL stress

如图5所示，在含75 mmol·L-1NaCl的生根培养基电导率为9.87mS·cm-1,显著高于对照3.07 mS·cm-1。而添加 0.05mg·L-1与 2mg·L-1GO 后，电导率分别为 10.28mS·cm-1与 10.14mS·cm-1，均高于单独NaCl胁迫处理的培养基电导率，两种浓度GO均使培养基电导率显著升高。本实验中培养基电导率发生变化，GO表面具有负电荷使培养基电导率升高。

3 结论与讨论

Nacl胁迫对植物个体形态发育具有显著的影响,整体表现为抑制植物组织和器官的生长。此次研究表明，适当浓度的GO添加可减轻盐胁迫对植株的伤害，促进植株在盐胁迫环境下根系的形成和植株生长。

氧化石墨烯可以吸附溶解性有机质（DOM），同时,氧化石墨烯对重金属离子、有机物等水体污染物也具备高吸附能力[5]。自然水环境中的DOM,包括腐殖酸、氨基酸、蛋白质等,与氧化石墨烯通过π-π作用力、氢键和Lewis酸碱作用力等机制发生吸附行为[6]。此次研究中氧化石墨烯的两种浓度都处于较低水平，两种浓度氧化石墨烯对高浓度的Na离子吸附作用并不强烈。

植株在盐胁迫条件下,体内保护性酶(SOD、POD、CAT)能相互协调以降低植物体内氧自由基水平,以维持植物体正常生长、代谢。此次研究表明单独Nacl处理植株根系中三种保护酶活性仅POD较对照明显升高，其余两种酶活性均较对照下降。植株茎段中SOD、POD两种酶活性显著降低。在盐胁迫下树莓根系生长受到抑制，根系通过提高POD酶活性来清除H2O2。Nacl处理后添加GO植株根系三种保护酶活性显著降低，而茎段中SOD、POD酶活性显著升高。笔者认为氧化石墨烯作为纳米材料能够渗透进入植物根系细胞（研究结果待发表），并对有机物具有极强的吸附作用。氧化石墨烯能够吸附抗氧化酶，并且其具有的巨大表面积能够为其提供反应位点，提高反应效率。

综上所述，氧化石墨烯的添加能够缓解盐离子对植物的伤害，同时能够通过吸附作用提升抗氧化酶反应效率，提升植株抗氧化能力。