油用牡丹根结线虫拮抗菌株的筛选和鉴定

李克勤，朱文成，曲永蕴，刘 慇，赵海军，李广强，季延平*

﹙1.莱州市文峰路街道农业综合服务站，山东 莱州261431；2.山东省林业科学研究院森林保护研究所，山东 济南 250014；3.菏泽市牡丹区牡丹研究所，山东 菏泽 274000；4.枣庄市三农服务中心，山东 枣庄 277000﹚

根结线虫（Meloidogyne）世界性分布，可以侵染果树、蔬菜、粮食作物、经济作物以及观赏植物等3000多种植物，造成严重的经济损失，是一类重要的植物病原[1]。油用牡丹是我国独有植物，原生物种，品种主要为“凤丹”和“紫斑”，出油率30%以上，其中α-亚麻酸含量达42.34%[2]。但是，随着油用牡丹栽培面积的迅速扩展，油用牡丹病害的发生危害呈上升的趋势[3]。由于根结线虫的危害，油用牡丹籽产量和品质已经受到严重影响，对当地经济造成沉重打击。针对油用牡丹根结线虫病的防治，主要以高毒、高残留的化学杀线虫剂为主，长期使用污染土壤和水体，破坏生态环境，严重威胁人类健康。研究发现，近年来，国内外研究人员一直关注寻找杀线活性稳定并能够大规模生产开发的微生物来防治根结线虫[4-6]。研究发现，捕食线虫真菌[7,8]、内寄生线虫真菌[9]、机会真菌[10,11]、产毒真菌[12]等食线虫真菌，寄生细菌[13,14]以及放线菌[9]等微生物具有杀线活性，可以用于线虫生物防治，控制其危害。

本文在油用牡丹根结线虫高效拮抗微生物筛选中，分离获得1株高效杀线细菌HZ087，测定了其发酵液对油用牡丹根结线虫二龄幼虫、卵的杀灭效果，验证其生防潜力，并采用形态学特征、生理生化特性以及16SrDNA序列分析，对HZ087菌株进行鉴定，以期为油用牡丹根结线虫病的生物防治提供新的生防资源。

1 材料和方法

1.1 菌株分离

在山东省林科院试验苗圃、寿光蔬菜大棚、菏泽市牡丹田，采集根际土壤样品。采用稀释分离法，称取5g样品，将样品放入有50mL无菌水和有玻璃球的三角瓶中振荡15min，将上清液依次稀释，10-2-10-7，取100μL 10-5-10-7上清液均匀涂布于NA培养基上，25℃培养，72h后将单菌落接种到NA培养基上，4℃保存、备用。

1.2 供试根结线虫的繁殖与准备

从感病的油用牡丹根部收集根结线虫新鲜卵块，1%NaClO溶液表面消毒，无菌水冲洗3次，置于25℃恒温箱中。待孵化后收集幼虫，配制根结线虫液（100条/mL），4℃保存、备用。

1.3 杀线活性菌株的筛选

将分离获得的细菌 25℃、200rpm振荡培养48h，分别吸取1mL发酵液和0.5 mL线虫液加入到灭菌的培养皿中，混合均匀，置25℃下培养48h，以不接菌的液体培养基为空白对照。每个处理重复3次。在培养皿中加入2滴0.05%亚甲基蓝溶液，10min镜检，虫体蓝色表示死亡，活虫不着色的表示正常[15]。分别统计死亡线虫数和总虫数，计算线虫死亡率。

1.4 HZ087菌株发酵液对油用牡丹根结线虫2龄幼虫的毒杀效果测定

将HZ087菌株发酵液稀释成5倍、10倍等2个梯度，测定方法同1.3。

1.5 HZ087菌株发酵液对油用牡丹根结线虫卵的毒杀效果测定

将被根结线虫侵染的油用牡丹根剪碎后置于三角瓶中，加入100mL 0.5%的NaClO溶液，振荡2min，快速倒入200-500目筛组中，自来水冲洗10min，收集500目筛网中的卵，稀释成3000粒／mL的卵悬浮液。毒杀效果测定采用室内离体培养法。在培养皿中加入2mL根结线虫卵悬浮液，再加入相应的HZ087发酵液，配置成2倍、5倍、10倍等3个梯度，清水作对照，重复 3次，分别在 4d、6d、8d和10d观察卵的孵化情况。

1.6 菌株鉴定

1.6.1 形态学鉴定

将菌株进行菌体形态染色，观察培养性状、生理生化指标测定。

1.6.2 分子生物学鉴定

采用细菌DNA提取试剂盒提取菌株DNA。菌株16S rRNA基因片段PCR扩增及序列测定。引物： 所用引物细菌通用引物 B27F （5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′）；1492R （5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），由上海派森诺生物科技有限公司合成。

PCR反应体系：50 μL反应体系，包括：2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 ×Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 5 μL，模板 DNA 1 μL，10 μmol/L 引物各 1 μL，5 U/μL Taq 酶 0.5 μL，双蒸水 32.5 μL。PCR 扩增条件：94 °C 预变性 5 min；94 °C 变性 0.5min，52 °C 退火 0.5min，72 °C 1 min，30 个循环；72 °C 10 min[16]。

将获得序列在 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中进行比对，选取12株Bacillus sp.菌株，以Streptomyce albofaciens JCM 4342作为外围菌株。利用MGEA 7.0中的Clustal W对各基因序列进行比对，然后利用MEGA 7.0软件采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树，以自展法（Bootstrap）进行检测，共循环1000次。

1.7 数据处理与分析

数据处理采用SPSS 20.0软件，差异显著性分析采用Duncan氏多重比较法。

2 结果与分析

2.1 杀线菌株筛选

由表1可知，室内测定的561株菌株中，有217株菌株在一定程度上表现出杀伤油用牡丹根结线虫二龄幼虫的能力。用浓度为109cfu/mL的菌悬液处理幼虫48h，校正死亡率在90%以上有1株菌株，占0.46%；校正死亡率在80%-90%有6株菌株，占1.97%；校正死亡率在70%-80%的有26株菌株，占11.98%。

表1 处理48h油用牡丹根结线虫二龄幼虫室内校正死亡率在70%以上的菌株

2.2 HZ087发酵液对油用牡丹根结线虫二龄幼虫的抑制作用

从表2可以看出，处理 12h、24h、36h和 48h后，随着处理时间的增加，HZ087发酵液对2龄幼虫的抑制作用越来越强，而清水对照组的抑制率基本不变。处理相同时间内，不同发酵液浓度对油用牡丹根结线虫二龄幼虫的抑制作用不同，稀释5倍液的抑制效果显著高于稀释10倍液和清水对照。在处理后48h，发酵液稀释5倍液的校正死亡率达到90.83%。

表2 HZ087对油用牡丹根结线虫二龄幼虫活力的抑制作用

2.3 HZ087发酵液对油用牡丹根结线虫卵孵化率的影响

从表3可以看出，HZ087发酵液不同稀释倍数处理后，油用牡丹根结线虫卵的孵化率不同。稀释倍数越高，卵的孵化率越高，稀释倍数与卵的孵化率成正比。同一稀释倍数，随着处理时间的增加，卵的孵化率增加。HZ087菌悬液2倍稀释液处理后的第4d，根结线虫卵的孵化率最低，7.27%，抑制效果随着稀释倍数增高成递减。HZ087发酵液稀释10倍处理第10d，根结线虫卵的孵化率为64.77%，仅低于清水处理。

表3 HZ087发酵液处理后油用牡丹根结线虫卵的孵化率

2.4 菌株鉴定

2.4.1 HZ087菌株形态特征

HZ087菌株革兰氏染色阳性，周生鞭毛，杆状、长为6.2～12.1μm，宽0.9～1.5μm。在NA培养基上25℃培养48h后，菌落平展、乳白色、圆形，表面不规则，中间有圆环形突起，边缘不整齐，不产色素。在NB液体培养，棕黄色，浑浊，有沉淀，形成菌膜。

2.4.2 HZ087菌株生理生化特性

NaCl浓度在2%～10%之间HZ087菌株生长性状一致。氧化酶阳性，硝酸盐还原试验弱阳性，能利用柠檬酸盐，能产生尿素酶分解尿素，不产H2S，VP试验阳性，能利用苦杏仁苷、ZT，具体见表4。

表4 HZ087菌株的生理生化特性

2.4.3 HZ087菌株基于16S rDNA的系统发育分析

将HZ087菌株的16SrDNA扩增序列在NCBI数据库中比对，与Bacillus amyloliquefaciens同源性为99%。采用邻接法（Neighbor-Joining）构建的NJ系统发育树。由图1可知，NJ系统发育树中，标尺指示0.02步变化，节点处为自展率，分支长度和为0.4422。HZ087菌株与B.amyloliquefaciens JC-07、B.amyloliquefaciens S2QPS31菌株聚在一个分支上，自展率为99%，表明HZ087菌株为B.amyloliq uefaciens，结合HZ087菌株的形态特征、生理生化特性，鉴定HZ087菌株为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。

图1 利用邻接法（NJ）基于HZ087菌株16SrDNA基因数据构建的系统发育树。自展支持率标注于节点处，标尺指示0.02步变化。

3 结论与讨论

根结线虫的生防因子有真菌、细菌、病毒和原生动物等，由于细菌易培养、繁殖速度快，后期易加工等特点，生防细菌在根结线虫生物防治研究中占有重要地位。目前研究比较多的有巴氏杆菌、假单胞菌、苏云金杆菌、坚强芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等[13,14,17-20]。本研究从土壤中分离获得1株对油用牡丹根结线虫具有较强杀线活性的细菌菌株HZ087，根据形态特征、生理生化特性以及16SrDNA序列分析，鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。1943年Fukumoto首次发现了解淀粉芽孢杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens），1987年 Priest确立为一个单独的种。解淀粉芽孢杆菌在自然界广泛存在，可以用来防治植物真菌病害、细菌病害、线虫、植物病毒等，具有开发成生物农药的潜力，应用前景广阔，是一类重要的优良的生防微生物资源。室内测定发现，HZ087发酵液不仅对油用牡丹根结线虫2龄幼虫具有较强的抑制作用，而且可以抑制卵的孵化。拮抗细菌可以产生杀毒物质直接杀死线虫、通过占据营养和空间位点来抑制根结线虫，也可以在“细菌-寄主-根结线虫”系统中，通过分泌物质改变寄主根系分泌物，避免线虫危害寄主植物。本研究获得解淀粉芽孢杆菌HZ087菌株对油用牡丹根结线虫的作用机理还需要进一步研究。

本试验只是在离体条件下测定抑制效果，田间土壤中微生物种类繁多，土壤环境复杂，HZ087菌株能否有效定殖、防治效果还有待进一步研究。