大叶女贞染色体制片及核型分析

孙 音 ，李兆鹏 ，2，房义福 *，姜楠南 ，王 媛

（1.山东省林业科学研究院，山东 济南 250014;2.青岛农业大学园林与林学院，山东 青岛 266109）

大叶女贞 （Ligustrum compactum）别名高杆女贞，木犀科、女贞属，灌木或小乔木，半常绿[1]。具有重要的园艺和药用价值，有滞尘抗烟的功能，能吸收二氧化硫,常作行道树和公园绿化树种[2]。植物染色体是基因定位、构建物理遗传图谱的重要前提，植物染色体研究最常用、最直观的的方法是染色体制片，镜检进行核型分析[3]。染色体核型分析技术可以将染色体逐一识别，对各项稳定特征如染色体的数目、大小、相对长度、着丝点位置、不对称系数等进行分析，作为植物分类指标被利用[4,5]。同时染色体研究对于基因定位、杂种分析、生物的遗传机理研究和种族关系鉴定等方面具有重要参考价值[6]。已知木犀科植物染色体基数为x=11-24，但相关的核型分析较少，一方面是由于木本材料的制约，另一方面木犀科植物染色体小、形态不易观察，制片技术有待于深入研究。目前仅限于几个属植物的研究，如木犀属桂花染色体基数为X=23，核型公式为2n=46=30m+6sm+8st+2t，属于“2B”类型[7]；白蜡属绒毛白蜡染色体基数为X=22，核型公式为2n=22=20m+2sm，为“1A”类型[8]；茉莉花属茉莉染色体基数为X=13,核型公式为2n=26=8m+16sm+2sm，为“3B”类型等[9]。已知女贞属植物染色体基数为X=23，核型分析还未见报道，而大叶女贞作为女贞属典型代表，对其进行染色体核型分析，对女贞属植物系统发育研究和亲缘关系鉴定具有重重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料取自2017年济南市唐王和长清苗圃采收的大叶女贞种子，选择颗粒饱满的种子消毒后剥胚放在垫有湿润脱脂棉的培养皿中，于25℃组培室中萌发。

1.2 方法

1.2.1 染色体制片

分别选取大叶女贞根尖和茎尖[10]为材料，在7:00-12:00时间段内分次取样，每隔30min取材1次，确定最适宜的取材时间。材料分别经0.02%秋水仙素、0.002mol/L 8-羟基喹啉、饱和对二氯苯、冰水[11,12,13]处理2～8h，2h为一个梯度，确定最适宜的预处理液和预处理时间。预处理后，蒸馏水漂洗2～3遍后于卡诺式固定液中室温固定24小时。蒸馏水漂洗2-3遍，分别经酶解法和酸解法解离，酸解时间分别为5～25min，5min为一个梯度。酶解法时，选择有无0.075mol/L KCl低渗液两组处理，酶解时间分别为90～150min，10min为一个梯度。以确定最适宜的解离方法和时间。解离后，蒸馏水冲洗2～3遍，将材料于载玻片上，滤纸吸干周围的水分，滴加1～2滴醋酸洋红或卡宝品红染液，分别染色5min，15min，25min，以确定最佳染色时间。染色后，运用常规压片法和改良去壁火焰干燥法制片。

1.2.2 细胞学观察及数据分析

选取5～10个植株的新生根尖进行核型分析，使用OLYMPUS显微镜100倍油镜进行镜检并拍照。运用Adobe Photoshop图像处理软件，对分裂中期的大叶女贞染色体进行数据测量并计算染色体组总长度、染色体臂相对长度、臂比、臂指数、不对称系数等参数[14]。染色体数目的确定和核型分析参照李懋学和陈瑞阳[15]关于植物核型分析标准化建议，参照Levan[16]等的染色体命名规则描述核型公式；按Arano[17]方法计算核不对称系数；按Kuo[18]等等方法计算相对长度；按Stebbins[19]方法确定染色体类型。

2 结果与分析

2.1 染色体制片的优化

2.1.1 取材部位对制片效果的影响

正常萌动根尖和茎尖为染色体制片常用的取材部位，但实验结果表明以茎尖为取材部位时，成像不够清晰，染色体难以计数，而大叶女贞播种苗待胚根长出2～3cm时取样，所获得染色体图像清晰，染色体形态良好，结果稳定，重复性高，见图1。

图1 大叶女贞茎尖、根尖及染色体图像Figure1 The stem apex and the chromosomes

2.1.2 取材时间点对分裂相细胞数的影响

实验证明上午9:30-10:00是观察大叶女贞染色体较好的时期，视野中的细胞分裂旺盛，分裂相较多，中期细胞的平均百分比为30%，其它时间段镜检也能观察到分裂中期相，但比例相对较小。

图2 根尖染色体不同取材时间中期细胞百分比Figure2 The apical chromosomes at 9:00-10:00 and the percentage of the divisition cells in mitosis metaphase at different sampling times

2.1.3 不同预处理液对制片效果的影响

通过对预处理液实验发现，在8-羟基喹啉、饱和对二氯苯处理2-8h，染色体浓缩程度过高，不利于观察；选用冰水处理的材料，染色体浓缩程度低，不利于染色体分散和计数；而经秋水仙素处理6h时便于形态观察和分析，制片效果较好，见图3。

2.1.4 不同解离液对制片效果的影响

酸解法和酶解法都能获得较好的染色体中期分裂相，通过对比试验得出：酶解法时，用1mol/L HCL处理15min效果最佳，见图4。酶解法时，采用有无KCL低渗液两个处理，对比试验发现，低渗过程对女贞染色体制片影响较小，因此为提高实验效率，省去前后低渗过程，酶解最佳时间为120min～130min。处理时间过短，细胞分散程度低，细胞重叠在一起；而处理时间过长，染色体遭到破坏，断裂成片段，影响数目统计和分析，表1。

图3 预处理6h对染色体长度的影响Figure3 Effect of pretreatment 6h on chromosome length

图4 酸解法解离时间对染色体的影响Figure4 The effect of acid dissociation time on chromosomes

表1 不同解离时间的效果比较Table1 Effect of different dissociation time

用醋酸洋红和改良石炭酸品红 （卡宝品红）染液分别着色，二者染色效果相差不大，且均染色15min为宜，染色时间过短，染色体不能完全着色，成像模糊，难以计数；染色时间过长，视野偏暗，染色体颜色太深，不易观察。

图5 染色时间对染色体成像的影响Figure5 The effect of dyeing time on chromosomes

根据上述实验条件的筛选，于上午10:00选取根尖1mm乳白色部分，秋水仙素预处理6h，卡诺固定液常温固定24h，1mol/L HCL解离10min，压片法和火焰干燥法制片。结果表明，两种制片方法都能获得良好的染色体分裂相，压片法制片时，便于镜检观察及拍照，但实验中，染色体分散效果差，获得可用于计数及核型分析的细胞概率较低。而用火焰干燥法时，表面张力使染色体自行铺展，分裂相清晰，同时无染色过程，方便进行染色体后续研究。

2.2 染色体核型分析

镜检找到大叶女贞中期分裂相，染色体核型分析数据如表2。大叶女贞染色体总条数为46，基数为23，与早前国外报道的染色体数目一致。核型公式为 2n=2x=46=38+4sm+4st，1号和2号染色体长臂具随体。中部着丝点（m）染色体19对，近中部着丝点（sm）的染色体2对，近端部着丝点（st）的染色体2对。臂比大于2的染色体有3对，占比为12%，最长染色体与最短染色体长度比为6.35，核型类型属于Stebbins核型分类中的“2C”型，臂指数为88，核型不对称系数为60.17%。较不对称，属于进化的核型类型。

表2 大叶女贞染色体核型参数Table2 Karyotype parametres of chromosomes of Ligustrum compactum

图7 大叶女贞染色体核型模式图Figure7 Karytope pattern of Ligustrum compactum

3 讨论

一般来说，能进行细胞分裂的植物组织、细胞等都可以为样本进行染色体制片[20]。高进红等[21]利用幼叶获得了银杏清晰的染色体标本，陈劲枫等[22]利用卷须获得了黄瓜、葡萄等植物清晰的染色体图像，郝爱平和詹亚光等[23]利用植物愈伤组织进行取材并优化了白桦染色体制片。实验以大叶女贞根尖和茎尖为取材部位，发现茎尖为材料时，细胞易重叠，成像不够清晰，可能是大叶女贞茎尖分生组织细胞连接结构力大，细胞难以分散。用根尖为实验材料，制片效果好，且易获得大量实验材料，不受外界环境的限制。刘丹[24]认为一天中植物分裂旺盛期一般出现在8:00-11:00，韩毅科[25]在对黄瓜的核型分析中得出8:40-9:10是取材的最佳时间，该实验得出上午9:00-10:00左右取样，约30%的细胞处于分裂中期，分裂中期相占比高，与之前报道一致。预处理的目的在于阻止和破坏纺锤体微管形成，使细胞分裂停滞在中期阶段，染色体浓缩变短，便于观察[26]。对二氯苯处理染色体，分散效果好；秋水仙素处理能提高中期分裂相比例；8-羟基喹啉可使染色体及缢痕和次缢痕清晰，适合染色体较大的植物；冰水处理百合科植物的效果较好[27]。但不同植物中作用效果可能有差异，适宜处理时间也不同。大叶女贞经秋水仙素6h处理的染色体形态良好，8-羟基喹啉、饱和对二氯苯处理，染色体浓缩程度高，冰水处理时，染色体之间相互交叉重叠，粘连不分散。说明对于像大叶女贞这种具小染色体且数目相对较多的植物，秋水仙素是较为温和的预处理液。酸解法步骤简便，易掌握，压片后，多呈现单细胞状态，细胞壁包裹染色体。酶解法溶解细胞壁，原生质体脱离，背景清晰[24]。在大叶女贞染色体制片中，酸解法和酶解法都能获得良好的制片效果，且为简化实验流程，去掉低渗步骤，但解离时间需要严格控制。杨宁等对百里香的核型分析中最佳酸解时间为15min[28]；陈晶鑫对梅花核型分析中最佳酶解时间为1h[29]。大叶女贞染色体较小，解离时间不宜太长。改良卡宝品红适合大多数植物的染色，使染色体着色而细胞质背景清晰，提高了对比度，而醋酸洋红染液只作临时镜检观察。材料不同，染色时间也有差异[24]。实验中两种染色液染色效果较理想，说明该植物材料较易染色。实验采用压片法获得清晰分裂相，为验证所试材料的可操作性，同时对火焰干燥法进行改良，酶解省去低渗过程，制片效果好，为以后该方法的使用提高了效率。

实验得到的大叶女贞染色体数目与之前报道的女贞属植物一致，核型公式为2n=2x=46=38m+4sm+4st，核型类型属于Stebbins核型分类中的“2C”型，核型不对称系数为60.17%。较不对称，在木犀科报道的几个属的植物中，属于较进化的类型，说明女贞属植物的起源相对较晚。

本文探讨了大叶女贞染色体制片方法，简化了实验流程，对女贞属其它植物的染色体制片提供了技术支持。同时初步分析了大叶女贞的核型类型。但对于染色体显带、原位杂交、大叶女贞以及女贞属在木犀科植物中的进化关系等问题还有待于进一步研究。