固相萃取-HPLC法同时测定盐酸帕洛诺司琼注射液中6种杂质

杜有国 ，王张权 ，孙 平 ，李 飞 南京医科大学，南京 6；江苏奥赛康药业有限公司，南京

盐酸帕洛诺司琼，化学名称为（3a S）-2-[（S）-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-2，3，3a，4，5，6-六氢-1-酮-1H苯[并]异喹啉盐酸盐，是一种亲和力较强的5-HT3受体选择性拮抗型止吐剂，美国综合癌症网络的临床指南已推荐盐酸帕洛诺司琼注射液作为首选药物，用于预防高度致吐化疗引起的急性恶心、呕吐及预防中度致吐化疗引起的恶心、呕吐。

盐酸帕洛诺司琼注射液由瑞士MgiPharma Inc.及其合作伙伴Hnelsinn Healthcare Sa研制开发，并于2003年7月25日首先在美国获准上市，规格为5mL∶0.25mg。盐酸帕洛诺司琼原料药已被《美国药典》收载，并对其杂质 A、B、C、D、E 和对映异构体进行了控制。盐酸帕洛诺司琼注射液及其他剂型均未被国内外药典收载。

目前盐酸帕洛诺司琼注射液有关物质特定杂质检测方法主要包括液相色谱直接测定[1]、有机溶剂提取浓缩后液相色谱检测[2]、干燥蒸发浓缩后液相色谱检测[3]等。

这些方法存在的问题包括大量的辅料影响色谱柱寿命，多次有机溶剂提取富集对人员操作要求高、对环境有污染，方法不能同时对样品中可能存在的杂质A、B、C、D、E和对映异构体进行一次性检测等[1-8]。本文利用固相萃取小柱（SPE），通过调节盐酸帕洛诺司琼注射液的pH、选择洗脱温度、优化洗脱溶剂等去除样品中辅料，富集样品中待测杂质A～E、对映异构体和主成分，实现了在不使用大量有机溶剂的情况下，同时检测盐酸帕洛诺司琼注射液中杂质A～E和对映异构体。本方法显著提高了分析效率和稳定性，具有简捷、经济、绿色和高效的特点。

1 实验部分

1.1 仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪；CPA225D电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；Milli-Q超纯水机（默克密理博公司）。

1.2 药品与试剂

对照品：盐酸帕洛诺司琼 （纯度99.7%，批号101030-201703，中国食品药品检定研究院）；杂质B（纯度 100%，批号 F02770，USP）；杂质 C（纯度 96.4%，批号S17042409-2，江苏奥赛康药业有限公司）；杂质D（纯度 88%，批号 F02790，USP）；杂质 E（纯度 100%，批号 F027A0，USP）；对映异构体（批号 F027B0，纯度100%，USP），各结构式见图1。盐酸帕洛诺司琼注射液（批号 20180801、20180802、20180803，规格5mL∶0.25mg，江苏奥赛康药业有限公司）；乙腈、四氢呋喃为色谱纯，其他试剂为分析纯；纯化水。

图1 盐酸帕洛诺司琼及各杂质结构式

1.3 方法

1.3.1 高效液相色谱条件 分析柱：Astec CHIROBIOTIC®V（250mm ×4.6mm，5μm）；流动相：四氢呋喃-20mmol·L-1醋酸铵（冰乙酸调 pH 6.0）=10∶90；柱温：35 ℃；流速：1.5mL·min-1；检测波长：238 nm；进样量：100μL。

1.3.2 样品前处理 取本品6瓶，合并摇匀，精密量取27mL置适当容器中，精密加入1mol·L-1氢氧化钠溶液 1mL，混匀，取该溶液 15mL，置 Agilent Bond Elut C8（200mg，3mL）固相萃取小柱上，通过重力使溶液经过小柱富集，再依次用1.5mL纯水、1.0mL 溶剂 A[乙腈-水-三氟乙酸（280∶720∶0.67）]对萃取小柱进行洗脱，弃除洗脱液。最后用1mL无水乙醇洗脱小柱，收集无水乙醇洗脱液置2mL量瓶中，用0.02mol·L-1醋酸铵溶液（冰醋酸调节pH值至6.0）稀释，定容至刻度，置4℃冰箱中冷藏约10min，过滤，取此滤液作为供试品溶液，上机检测。

2 结果与讨论

2.1 富集溶液pH选择

盐酸帕洛诺司琼注射液pH约为5，直接使用SPE小柱富集，各杂质和主成分在富集时即损失。参考各组分结构，可调节样品溶液pH至碱性，改变各组分在SPE柱上的保留，实现辅料去除，待测组分保留。实验考察了样品在pH 5～11.5各组分的保留情况。结果表明，样品溶液pH调节为10.0～11.5，滤液中除辅料外，均未检出待测各组分，故最终样品溶液pH设定为11.0。

为了实验的简捷性和可操作性，考察了样品pH与样品中加入氢氧化钠溶液的浓度和体积关系。结果表明，精密量取样品27mL，加入1mol·L-1氢氧化钠溶液1mL，混匀，即可得到所需pH的富集溶液。

2.2 富集温度选择

洗脱温度可能会对固相萃取小柱的选择性产生影响。实验考察了洗脱温度为4℃、15℃、20℃、35℃时洗脱能力。结果表明，各温度下，洗脱液中均无待测组分被洗脱，故最终洗脱温度选择室温。

2.3 洗脱溶剂选择

样品经固相萃取小柱富集后，需使用合适的溶剂洗脱萃取小柱中残留的辅料，收集富集物。实验考察了不同体积水对固相萃取小柱中辅料的洗脱能力。结果表明，经过1.5mL水洗脱后，萃取小柱中辅料已经基本洗脱完全。

固相萃取小柱富集样品后呈现碱性，如需使用小体积溶剂将待测组分洗脱出来，需对SPE柱进行酸化处理。实验考察了不同体积、不同比例的水-20mmol·L-1醋酸铵、水-三氟乙酸、乙腈-水-三氟乙酸等对SPE柱进行酸化。结果表明，使用洗脱剂乙腈-水-三氟乙酸（280∶720∶0.67）以 0.8mL、1.0mL、1.2mL对固相萃取小柱洗脱，洗脱液中均无待测组分洗脱出来，当1.5mL洗脱液时，组分开始损失，故选择用洗脱液乙腈-水-三氟乙酸 （280∶720∶0.67）以1.0mL对SPE柱进行洗脱。

为了达到检测灵敏度，需使用少量溶剂对各组分进行富集。实验分别考察了甲醇、乙腈、无水乙醇等液相常用溶剂作为富集溶剂时各组分的富集情况。结果表明，在富集溶剂体积允许的范围内，甲醇、乙腈不能将所有待测组分全部洗脱，无水乙醇能够将待测各组分进行全部富集，最终选用1mL无水乙醇作为富集溶剂。

2.4 洗脱液处理

使用无水乙醇富集待测组分后，由于溶剂效应，色谱图中出峰较早的组分峰形较差。故结合HPLC流动相组成和待测组分所需灵敏度，选择将富集溶液用0.02mol·L-1醋酸铵溶液（冰醋酸调节pH值至6.0）稀释1倍，并且在4℃冰箱中冷藏约10min，过滤，进一步去除残留的微量辅料作为供试品。

2.5 分析方法的评价验证

2.5.1 专属性实验 取杂质A～E、对映异构体、盐酸帕洛诺司琼对照品适量，用乙醇-0.02mol·L-1醋酸铵溶液（冰醋酸调节 pH 值至 6.0，50∶50）溶解，稀释制成约含各杂质2μg·mL-1、帕洛诺司琼0.4mg·mL-1的溶液，作为系统适用性溶液；取空白辅料溶液，按照“1.3.2”样品前处理方法处理，作为空白辅料检测溶液。精密量取上述溶液，按照“1.3.1”色谱条件进样检测，记录色谱图。结果表明，空白辅料无干扰，各杂质均可被检出，分离度良好。表1为分离度测定结果，图2为系统适用性图谱。

表1 各组分分离度

图2 盐酸帕洛诺司琼注射液系统适用性色图谱

2.5.2 线性及范围 分别精密称量各杂质对照品，用适当乙醇-0.02mol·L-1醋酸铵溶液 （冰醋酸调节pH值至6.0，50∶50）溶解，稀释制成混合对照品溶液；精密量取一定体积的混合对照品溶液，用溶剂稀释制成每毫升中约含各杂质 0.2、0.4、0.8、2.1、4.3 μg的系列混合对照品溶液，按照“1.3.1”色谱条件进样检测，以目标物的浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，峰面积（Y，mAU*s）为纵坐标进行线性回归，线性回归方程和相关系数见表2。

表2 各杂质线性方程、相关系数（r）及线性范围

由表 2 可知，在 0.2～4.3μg·mL-1线性范围内，6个杂质均具有良好的线性关系，相关系数r均大于0.999 5。

2.5.3 检测限和定量限 取已知浓度的 “线性溶液”逐级稀释，测定的信号与空白处的信号（信噪比）进行比较，当信噪比为10∶1，且重复6次进样精密度的相对标准偏差（RSD）不大于10%时，确定此浓度为定量限，将信噪比为3∶1的浓度作为检测限浓度，结果见表3。

表3 各杂质检测限和定量下限（n=6）

由表3可见，该方法中各待测杂质的检测限为0.056～0.065 μg·mL-1，定量限为 0.19～0.22 μg·mL-1，约为供试品浓度的0.05%。

2.5.4 方法的回收率 精密量取盐酸帕洛诺司琼注射液27mL，精密加入1mol·L-1的氢氧化钠溶液1mL，摇匀，精密量取上述溶液15mL，平行配制9份，分为3组，每组3份。每组中分别精密加入一定体积、适量浓度的各杂质对照品溶液，制成含各杂质限度浓度50%、100%、150%溶液，作回收率测定。按照“1.3.2”样品前处理方法处理检测。见表4。

表4 各杂质加样回收率试验结果（n=9/3）

由表4可见，在低、中、高三个浓度水平下，方法的回收率为90.60%～105.7%。说明该方法准确度高。

2.5.5 方法的重复性 精密量取盐酸帕洛诺司琼注射液27mL，加入1mol·L-1的氢氧化钠溶液1mL，摇匀，精密量取该溶液15mL，平行配制6份。每组中分别精密加入一定体积、适量浓度的杂质对照品溶液，制成含各杂质限度浓度100%的溶液。按照“1.3.2”样品前处理方法处理检测，见表5。

表5 重复性试验结果

由表5可见，6份样品中各杂质RSD均小于6%，说明该方法重复性良好。

2.6 样品检测

取3批盐酸帕洛诺司琼注射液作为供试品溶液，按照“1.3.2”样品前处理方法及“1.3.1”色谱条件进样测定，样品中各杂质检测结果见表6。

表6 样品中各杂质测定结果

3 结 论

本实验建立了固相萃取-高效液相色谱法测定盐酸帕洛诺司琼注射液中6种已知杂质的分析方法。通过固相萃取去除样品中辅料，富集待测组分，实现了在不使用大量有机溶剂的条件下，同时检测样品中6种杂质。该方法验证结果表明，本法可获得很好的精密度、灵敏度和准确度，可用于同时测定盐酸帕洛诺司琼注射液中6种杂质。