利拉利汀中4种杂质的合成*

彭嘉勋，唐 平，翟诗圆，毛 雨，陈建芳

湖南工程学院化学化工学院，湖南湘潭 411101

利拉利汀（Linagliptin，1），商品名为 Trajenta，化学名为 8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-（7-（2-丁炔基）-3，7-二氢-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基）甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮，是由勃林格殷格翰公司开发的一种高选择性、竞争性的二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidaseⅥ，DPP-4）抑制剂。于2011年5月获美国FDA批准上市，能有效治疗2型糖尿病[1，2]。临床研究显示，利拉利汀单独或与其他抗糖尿病药（如二甲双胍、磺酰脲类药和唑烷二酮类药）联用均可降低低血糖的风险[2，3]。

目前文献报道的利拉利汀合成工艺较多[4-6]，主要的合成方法是以3，7-二氢-3-甲基-1H-嘌啉-2，6-二酮为原料，经过溴代反应、两次取代反应得到中间体 8-溴-7-（2-丁炔基）-3，7-二氢-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基） 甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮，再与（R）-3-（叔丁氧羰基氨基）哌啶反应，经脱保护得到利拉利汀。

本研究在参考利拉利汀的合成工艺与原料药HPLC法分析的文献时，发现了5个含量较多的可能杂质成分[7-9]。它们分别为 8-[（3R）-3-乙酰氨基-1-哌啶基]-（7-（2-丁炔基）-3，7-二氢-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基） 甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮（杂质 A）；8-[（3R）-3-甲酰胺基-1-哌啶基]-（7-（2-丁炔基）-3，7-二氢-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基）甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮 （杂质B）；8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-（7-（3-溴-2-丁烯基）-3，7-二氢-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基）甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮 （杂质 C）；8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-3，7-二氢-3-甲基-1-（2-丁炔基）-1H-嘌啉-2，6-二酮（杂质 D）；8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-（7-（2-丁炔基）-3，7-二氢-3-甲基-1-[（2-乙酰基）乙酰苯胺]-1H-嘌啉-2，6-二酮（杂质E）。

利拉利汀在结构上包含氨基哌啶片段，在生产过程中容易与乙酸或甲酸发生取代反应产生杂质A或者杂质B[4]。利拉利汀杂质C是由于原料1-溴-2-丁炔纯度不够而产生的[5]。另外，在引入炔基结构时，若没有控制好反应物的投料比例，容易引入杂质D[6]。在制备喹唑啉环过程中，如果关环反应不彻底，则带来了杂质E[6]。

为了对利拉利汀原料药质量控制提供杂质对照品，本研究合成了上述疑似5个杂质化合物。利拉利汀1与冰乙酸在40℃下发生酰化反应得到化合物A；利拉利汀1与甲酸乙酯在回流条件下发生取代反应得到化合物B；常温下利拉利汀1在HBr-CH3COOH溶液中发生加成反应得到化合物C。化合物A、B、C的合成路线见图1。

图1 化合物A、化合物B和化合物C的合成路线

8-溴-7-（2-丁炔）-3-甲基黄嘌啉2在碳酸钾的作用下与1-溴-2-丁炔发生取代反应得到中间体8-溴-7-（2-丁炔）-3-甲基-4-丁炔黄嘌啉 3；3 在碳酸钾的作用下与（R）-3-Boc-氨基哌啶发生取代反应得到中间体 8-[3（R）-3-Boc-氨基哌啶]-7-（2-丁炔）-3-甲基-4-丁炔黄嘌啉4；4在三氟乙酸的作用下发生脱保护反应得到 8-[3（R）-3-氨基哌啶]-7-（2-丁炔）-3-甲基-4-丁炔黄嘌啉D。D的合成路线见图2。

图2 化合物D的合成路线

以邻氨基苯乙酮为原料与氯乙酰氯发生取代反应得到中间体N-（2-乙酰基-苯基）-2-氯乙酰胺6；6在碳酸钾的作用下与 8-溴-7-（2-丁炔）-3-甲基黄嘌啉2发生取代反应得到中间体8-溴-7-（N-（2-乙酰基苯基）乙酰胺-2-基）-3-甲基-4-丁炔黄嘌啉7；7在碳酸钾的作用下与2发生取代反应得到中间体8-[3 （R）-3-Boc-氨基哌啶]-7-[（丁-2-炔）-1-基]-3-甲基-1-[N-（2-乙酰基苯基）乙酰胺-2-基]-黄嘌呤8；8在三氟乙酸的作用下发生脱保护反应得到 8-（3-氨基哌啶-1-基）-7-[（丁-2-炔）-1-基]-3-甲基-1-[N-（2-乙酰基苯基）乙酰胺-2-基]-黄嘌呤E。E合成路线见图3。

图3 化合物E的合成路线

1 仪器与试剂

BrukerAVANCE-500核磁共振仪（Bruker公司，TMS为内标，以氘代CDCl3或氘代DMSO为溶剂）；LC-20A高效液相色谱仪 （日本岛津公司）；薄层色谱采用薄层色谱硅胶板 （青岛海洋化工厂）；Agilent液质联用单四极杆质谱仪 （美国Agilent公司）；RY-Ⅰ型熔点测定仪 （天津市天分分析仪器厂），温度计未经校正。

硅胶粉（100～200目，青岛海洋化工厂分厂），实验所用试剂均为市售分析纯。

2 合成方法

2.1 8-[（3R）-3-乙酰氨基-1-哌啶基]-（7-（2-丁炔基）-3，7-二氢-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基）甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮（化合物A）的合成

将 1（1.2g，2.5mmol）溶于质量分数为 40%的乙酸溶液（10mL）中，40℃下搅拌6h。反应结束后将反应液浓缩至干，经硅胶柱层析分离纯化（石油醚∶乙酸乙酯=1∶1，v/v），得到白色固体 2（1.2g，91.8%），m.p.283.0℃～283.4℃。纯度99.2%[HPLC面积归一法：色谱柱 AgilentC18（4.6nm × 150nm，5μm）；流动相A为磷酸盐缓冲液 （2.0g磷酸二氢钠加水1000mL溶解，用磷酸调节pH值为2.5），流动相B为甲醇-乙腈（55∶45，体积比）；柱温：30 ℃；检测波长：226nm；流速：1mL·min-1；进样量：10μL；保留时间：7.5min]。

LC-MS（m/z）：515.3[M+H]+；1H-NMR（500MHz，DMSO） δ：1.80～1.87（m，9H，CC-CH3，piperidine-H），2.13～2.20（m，3H，COCH3），2.92（s，3H，C-CH3），3.01～3.08（m，2H，piperidine-H），3.63（s，3H，N-CH3），3.86～3.89（m，1H，CH），4.93（s，2H，CC-CH2），5.36（s，2H，N-CH2），7.71（s，1H，CO-NH），7.84～7.87（m，1H，Ph-H），7.95～7.98（m，2H，Ph-H），8.26～8.29（m，1H，Ph-H）；13C-NMR（125MHz，DMSO） δ：18.5，19.7，26.1，26.4，32.3，40.5，42.5，46.8，50.5，70.6，78.2，100.4，119.3，122.6，124.1，124.8，131.0，144.4，146.2，148.0，150.3，152.7，154.4，157.5，157.6，157.9，165.7。

2.2 8-[（3R）-3-甲酰胺基-1-哌啶基]-（7-（2-丁炔基）-3，7-二氢-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基）甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮（化合物B）的合成

将 1（1.2g，2.5mmol）溶于二氯甲烷（20mL）中，再缓慢滴加甲酸乙酯（1.0mL，12.5mmol），回流条件下搅拌12h。反应完全后将反应液浓缩至干，经硅胶柱层析分离纯化 （石油醚∶乙酸乙酯=1∶1，v/v）， 得到白色固体 B （1.1 g，86.6%），m.p.281.5℃～281.8℃。纯度99.0%（HPLC法条件同化合物A，杂质B的保留时间为8.2min）。

LC-MS（m/z）：502.5[M+H]+；1H-NMR（500MHz，DMSO-d6） δ：1.74～1.87（m，9H，CC-CH3，piperidine-H），2.90 （m，3H，C-CH3），3.01～3.06 （m，2H，piperidine-H），3.54（s，3H，N-CH3），3.56～3.58（m，1H，piperidine-H），3.65～3.68（m，1H，CHO），4.92（s，2H，CC-CH2），5.35（s，2H，N-CH2），7.69（s，1H，NH），7.84（d，J=10.0Hz，1H，Ph-H），7.95～7.98（m，1H，Ph-H），8.24～8.28（m，2H，Ph-H）；13C-NMR（125MHz，DMSO） δ：17.5，19.7，26.1，26.4，32.2，40.5，42.5，46.8，50.5，70.6，85.8，100.3，107.7，119.4，122.0，123.8，125.5，125.8，144.4，146.0，147.9，150.1，150.4，152.7，157.9，165.7。

2.3 8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-（7-（3-溴-2-丁烯基）-3，7-二氢-3-甲基-1-[（4-甲基-2-喹唑啉基）甲基]-1H-嘌啉-2，6-二酮（化合物C）的合成

将 1 （1.2 g，2.5mmol） 溶于 33%（质量分数）的HBr-CH3COOH 溶液 （20 mL，HBr气体溶解在CH3COOH中），回流条件下搅拌12h。反应结束后将反应液浓缩至干，经硅胶柱层析分离纯化（乙酸乙酯∶甲醇=20∶1，v/v），得到白色固体化合物 C（1.1 g，78.6%），m.p.258.9℃～260.3℃， 纯度 99.5%（HPLC法条件同化合物A，化合物C的保留时间为18.5min。合成的化合物C经HPLC考察，Rf值与原药的杂质C不一致，在以后的研究中将进一步观察，见图 4）。

图4 5个合成品（A）和利拉利汀粗原料（B）的HPLC色谱图

LC-MS（m/z）：553.2[M+H]+；1H-NMR（500MHz，DMSO-d6） δ：1.63～1.73（m，2H，piperidine-H），1.86～1.90（m，1H，CBr=CH-CH2），1.90～1.94（m，1H，piperidine-H），2.02～2.04（m，1H，piperidine-H），2.26（s，3H，C=CBr-CH3），2.92（s，3H，C-CH3），2.98～3.10（m，2H，piperidine-H），3.34（s，3H，N-CH3），3.41～3.45（m，2H，piperidine-H），3.68（d，J=15.0Hz，1H，piperidine-H），4.80 （s，2H，CC-CH2），5.36 （s，2H，N-CH2），6.11 （s，2H，NH2），7.72（d，J=10.0 Hz，1H，Ph-H），7.84（d，J=10.0Hz，1H，Ph-H），7.97 （d，J=10.0Hz，1H，Ph-H），8.28（d，J=10.0 Hz，1H，Ph-H）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6） δ：3.1，21.2，23.2，29.4，33.1，35.5，45.5，47.8，49.5，57.6，73.7，81.1，103.2，122.5，125.7，127.0，127.7，134.1，147.8，148.9，150.8，153.2，156.1，160.7，168.9。

2.4 8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-3，7-二氢-3-甲基-1-（2-丁炔基）-1H-嘌啉-2，6-二酮（化合物D）的合成

将 8-溴-7-（2-丁炔）-3-甲基黄嘌啉 2 （3.0 g，10.1mmol）溶于 N，N-二甲基甲酰胺（30mL）中，加入无水碳酸钾（4.1 g，30.2mmol），再加入 1-溴-2-丁炔（1.4mL，15.5mmol），60 ℃下搅拌 6 h。反应毕，过滤，减压浓缩反应液，经硅胶柱层析分离纯化（石油醚∶乙酸乙酯=2∶1，v/v），得到中间体 3（2.6g，73.8%）。1H-NMR （500MHz，DMSO-d6） δ：1.74（s，3H），1.80（s，3H），3.40（s，3H），4.55（s，2H），5.09（s，2H）。

将 3（2.0 g，5.7mmol）溶于 N，N-二甲基甲酰胺（20mL）中，加入无水碳酸钾（2.3 g，17.1mmol），再加入（R）-3-Boc-氨基哌啶（1.7mL，8.6mmol），80 ℃下搅拌6 h。反应毕，过滤，减压浓缩反应液，经硅胶柱层析分离纯化（乙酸乙酯∶甲醇=10∶1，v/v），得到中间体 4（1.9 g，70.7%）。

1H-NMR （500MHz，DMSO-d6） δ：1.38（s，9H），1.53～1.66（m，4H），1.66～1.71（m，4H），1.71～1.78（m，5H），2.83（t，J=10.5Hz，3H），2.87（t，J=10.5Hz，3H），3.45～3.57（m，2H），3.58～3.64（m，3H），4.52（s，2H），4.85（s，2H），6.97（d，J=7.5Hz，1H）。

将 4（1.0 g，2.1mmol）溶于二氯甲烷（15mL）中，向反应液中加入三氟乙酸 （0.2mL，3.2mmol），室温下搅拌1 h。反应结束后，减压浓缩反应液，经硅胶柱层析分离纯化（乙酸乙酯∶甲醇=20∶1，v/v），得到白色固体化合物 D（0.72 g，91.5%），m.p.180.5℃～180.8℃，纯度99.5%（HPLC法条件同化合物A，化合物D的保留时间为19.5min）。

1H-NMR（500MHz，DMSO-d6）δ：1.43～1.53（m，4H，piperidine-H），1.69～1.76（m，5H，piperidine-H），2.63（t，J=10.5Hz，3H，C-CH3），2.98（t，J=10.5Hz，3H，C-CH3），3.31～3.36（m，2H，N-CH2），3.78（s，3H，CCH3），4.42（m，2H，N-CH2），5.95（s，2H，NH2）；13C NMR（125 MHz，DMSO-d6） δ：3.3，3.4，20.4，24.5，29.4，30.7，36.7，37.8，49.9，66.0，73.8，77.6，79.5，79.8，107.4，150.1，151.2，154.9，168.5。

2.5 8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-（7-（2-丁炔基）-3-甲基-1-[N-（2-乙酰基苯基）乙酰胺-2-基]-1H-嘌啉-2，6-二酮（化合物 E）的合成

将 5（2.7 g，20.0mmol）溶于二氯甲烷（40mL）中，加入三乙胺（2.8mL，20.0mmol），常温搅拌 30min后再加入氯乙酰氯（2.4mL，30.0mmol），常温下搅拌8 h。反应结束后，减压浓缩反应液，经硅胶柱层析分离纯化（石油醚∶乙酸乙酯=3∶1，v/v），得到 6（2.9 g，68.7%）。

将 6（2.0 g，9.5mmol）溶于 N，N-二甲基甲酰胺（30mL）中，加入碳酸钾（1.3 g，9.5mmol），再缓慢加入 2（3.3 g，11.2mmol），50 ℃下搅拌 10 h。反应结束后，减压浓缩反应液，用水和二氯甲烷萃取两次。合并有机相，减压浓缩，经硅胶柱层析分离纯化（石油醚∶乙酸乙酯=2∶1，v/v），得到 6（2.4 g，54.5%）。

1H-NMR（500MHz，DMSO-d6） δ：1.85（t，J=2.5Hz，3H），2.64（s，3H），3.50（s，3H），4.75（s，2H），5.15（d，J=2.5Hz，2H），7.10～7.39（m，1H），7.60～7.77（m，1H），8.05（d，J=8.5 Hz，1H），8.30（d，J=8.5 Hz，1H），11.53（s，1H）。

将 7（1.0g，2.1mmol）溶于二甲基亚砜（20mL）中，加入碳酸钾（0.3 g，2.1mmol），再缓慢加入（R）-3-Boc-氨基哌啶（0.6 g，3.1mmol），50 ℃下搅拌 8 h。反应结束后，减压浓缩反应液，用水和乙酸乙酯萃取两次。合并有机相，减压浓缩，经硅胶柱层析分离纯化（石油醚∶乙酸乙酯=5∶1，v/v），得到 8（0.76g，61.1%）。

1H-NMR （500 MHz，CDCl3） δ：1.41 （s，9H），1.44～1.47（m，1H），1.64（d，J=10.5 Hz，1H），1.75（s，3H），1.77～1.92（m，2H），2.55（s，3H），2.79～2.90（m，1H），2.99（s，1H），3.39（s，3H），3.57（s，1H），3.60（d，J=12.5Hz，1H），3.65（d，J=11.5Hz，1H），4.65（s，2H），4.85 （d，J=2.0Hz，2H），6.95 （d，J=7.5Hz，1H），7.12～7.27（m，1H），7.50～7.66（m，1H），7.95～7.98（m，1H），8.30（d，J=8.5Hz，1H）。

将 8（1.2g，2.0mmol）溶于二氯甲烷（20mL）中，滴加三氟乙酸（0.7mL，10.0mmol），常温下搅拌 2h。反应结束后，减压浓缩反应液，经硅胶柱层析分离纯化（乙酸乙酯∶甲醇=10∶1，v/v），得到白色固体杂质 E（0.7 g，72.1%），m.p.165.5℃～165.9℃，纯度 99.1%（HPLC 法条件同化合物A，化合物E保留时间为15.0min）。

LC-MS（m/z）：492.2[M+H]+；1H-NMR（500MHz，DMSO-d6） δ：1.67～1.72（m，2H，piperidine-H），1.79（s，3H，COCH3），1.93～2.04 （m，2H，piperidine-H），2.59（s，3H，C-CH3），3.18～3.25（m，4H，piperidine-H），3.55～3.54 （m，3H，N-CH3），3.70 ～3.75 （m，1H，CH-NH2），4.68（s，2H，CC-CH2），5.02（s，2H，N-CH2），7.24（t，J=7.5Hz，1H，Ph-H），7.61（t，J=7.5Hz，1H，Ph-H），7.99（d，J=10.0Hz，1H，Ph-H），8.30（m，1H，Ph-H），11.49（s，1H，NH）；13C-NMR（125MHz，DMSO-d6） δ：18.7，24.1，25.5，26.4，32.3，41.1，42.9，47.0，48.1，70.4，78.2，100.4，117.4，120.1，121.2，121.9，128.5，131.0，135.3，144.4，147.6，149.8，152.3，163.6，199.5。

2.3 HPLC法对杂质的确认

将合成的5个化合物混合后经HPLC分离，同法将利拉利汀粗原料进行分离，结果见图4。可见化合物 A、B、D、E 的 Rf值与粗品中杂质 A、B、D、E 的Rf值一致。

3 结 论

为控制药品质量，本研究合成了利拉利汀中常见的 4 种杂质（A、B、D、E），提供给药检部门使用，具有一定的实际价值。化合物C与原药中杂质C的结构是否完全吻合将在未来进一步研究。