苯佐那酯软胶囊在中国健康受试者中的药代动力学研究*

满珈羽 ，焦菲菲 ，王逸雅 ，顾月清 ，舒 畅 **，丁 黎 **中国药科大学，南京 0009；南京科利泰医药科技有限公司，南京 00

苯佐那酯软胶囊具有疗效好、不良反应低、无成瘾性等特点，被美国胸科医师协会推荐为治疗癌症病人咳嗽的首选药物[1-5]。但是该药目前尚未在中国上市，且国内外没有关于苯佐那酯药代动力学研究的报道，因此了解苯佐那酯软胶囊中活性成分的浓度在中国健康受试者体内的经时变化过程对指导临床用药具有重大意义。再者，由于苯佐那酯是一种由15种聚合物单体组成的混合物，与代谢产物4-N-丁基氨基苯甲酸（BBA）间存在确定的量化关系。故本研究通过两种HPLC-MS/MS法分别测定了血浆中原始BBA的浓度（方法B）和总BBA的浓度（包含原始BBA的浓度和由苯佐那酯转化的BBA的浓度，方法A），根据总BBA浓度和原始BBA浓度的差值推算得到了血浆中苯佐那酯的浓度，并将其成功地应用于中国健康受试者单次及多次口服苯佐那酯软胶囊后的药代动力学研究。由于苯佐那酯会被基质中的酯酶快速水解为BBA，因此将含药全血样品在室温条件下放置2小时后离心，使苯佐那酯完全转化为BBA，以检测血浆中总BBA的浓度。为了检测血浆中原始BBA的浓度，必须抑制苯佐那酯的转化，因此在含药全血样品中加入酯酶抑制剂甲硫酸新斯的明[6]。现将本研究主旨予以报道。

1 材 料

1.1 药品和试剂

苯佐那酯软胶囊 （规格：100mg/粒、200mg/粒，批号：LC-B20170503、LC-B20170501， 石药集团恩必普药业有限公司）；BBA对照品 （纯度：99.7%，批号：2420-018A1，TLC）； 内标替米沙坦 （纯度：99.6%，批号：100629-201202，中国食品药品检定研究院）；甲硫酸新斯的明对照品 （批号：100550-200401，中国食品药品检定研究院）。

甲醇、乙腈（色谱纯，Merck KGaA）；甲酸、醋酸铵（ACS，Sigma-Aldrich）；试验用水为超纯水（Milli-Q制备）。

1.2 仪器与设备

岛津高效液相色谱仪 （液相泵：LC-20ADXR，柱温箱：CTO-20AC，控制器：CBM-20A Lite，脱气机：DGU-20A5R，自动进样器：SIL-30AC）；质谱仪（API 4000，Applied Biosystems/Sciex），质谱工作站（Analyst 1.6.2，Applied Biosystems/Sciex）；电子天平（Sartorius）；离心机（Thermo Fisher）等。

2 方 法

2.1 检测条件

离子化方式：电喷雾离子化（ESI）；离子极性：正离子；离子检测方式：多反应监测（MRM）；碰撞气压力（CAD）：7Unit；气帘气压力（CUR）：241.3 kPa；喷雾气压力 （GS1）：275.6 kPa；辅助加热气压力（GS2）：275.6 kPa；离子喷雾电压（IS）：5 500 V；离子源温度（TEM）：550℃。BBA和替米沙坦的离子对分别为m/z194.2→138.1和m/z515.3→497.3。电参数设置见表1。

表1 BBA和替米沙坦的电参数

色谱柱：Agilent Poroshell 120 Phenyl Hexyl（2.1mm×50mm，2.7μm）； 柱温：40℃； 流动相：含0.3%甲酸和5mmol·L-1醋酸铵的水溶液-乙腈 （60∶40）；流速：0.3mL·min-1；自动进样器温度：8 ℃；进样量：10μL。

2.2 标准溶液的配制

方法A：精密称取适量BBA对照品，用100%甲醇溶解配制成浓度为1.00mg·mL-1的BBA储备液；用50%甲醇水溶液稀释储备液，配制不同浓度的BBA对照品工作溶液。精密称取内标替米沙坦适量，用100%甲醇溶解成浓度为1.00mg·mL-1的替米沙坦储备液；用50%甲醇水溶液稀释，得到浓度为900ng·mL-1的内标替米沙坦工作溶液。

方法B：BBA对照品储备液、工作溶液及内标替米沙坦储备液的配制方式和浓度与 “方法A”一致。用50%甲醇水溶液稀释内标替米沙坦储备液，配制成内标工作溶液，浓度为 60.0 ng·mL-1。精密称取适量的甲硫酸新斯的明对照品，用超纯水溶解，配制成浓度为10.0mg·mL-1的甲硫酸新斯的明储备液。

2.3 标准样品的配制

方法A：在室温下，按1∶19的比例将BBA的工作溶液与空白血浆混合均匀，配制BBA的标准曲线样品和质控样品。其中，标准曲线样品浓度为10.0、20.0、100、500、2 500、5 000、8 000、10 000 ng·mL-1，低、中、高质控样品的浓度为 25.0、250、7500ng·mL-1。

方法B：在冰浴条件下，按1∶19的比例将BBA的工作溶液与含甲硫酸新斯的明的空白血浆混合均匀，配制BBA的标准曲线样品和质控样品，浓度与“方法A”一致。此方法中含甲硫酸新斯的明的空白血浆是由含甲硫酸新斯的明储备液的空白全血（25∶1000）离心所得。

2.4 样品前处理

方法A：在96孔板中，加入50μL血浆样品和30 μL 内标工作溶液（900 ng·mL-1）；涡旋 1min，向所有样品孔中加入370μL甲醇；将密封的96孔板充分振摇 10min 后离心（10℃、4000 r·min-1，10min）；取30μL上清液加至含有570μL 40%甲醇水溶液干净的96孔板中，涡旋混匀后进样分析。

方法B：在冰浴条件下，向含有800μL甲醇的EP管中加入100μL血浆样品；振摇10min后在10℃条件下以12 000 r·min-1离心10min； 取30μL上清液加至含有540μL 40%甲醇水溶液的干净的96孔板中；并向该96孔板中加入30μL内标工作溶液（60.0 ng·mL-1），涡旋混匀后进样分析。

2.5 药代动力学研究

本试验方案经过伦理委员会批准，服从《赫尔辛基宣言》中规定的伦理原则。经国家药品监督管理局批准，临床批件号为2016L06776。36名中国健康受试者（男女兼有），年龄18～45岁，自愿签署知情同意书并经过严格的实验室检查合格后，平均分为 A、B、C 3 组，分别进行低（100mg）、中（200mg）、高（400mg）剂量组的单次给药药代动力学研究，以及中剂量组的多次给药药代动力学研究。

A、B组受试者在空腹状态下分别单剂量口服1粒苯佐那酯软胶囊 （100mg/粒、200mg/粒），C组受试者单剂量口服2粒苯佐那酯软胶囊（200mg/粒）。于给药前 （0 h） 和给药后 0.167、0.333、0.5、0.667、0.833、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10 h 采 集 5 mL 全血。B组受试者单次给药结束后，第2天开展多次给药的药代动力学试验。连续两天 （第2天和第3天），每天给药3次（τ=6 h），第4天单次给药苯佐那酯软胶囊1粒。于第3天、第4天给药前（0 h）和第4 天 药 后 0.167、0.333、0.5、0.667、0.833、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10 h 采集 5mL 全血。 其中 2mL 推入至预冷的采血管B中（EDTA-K2抗凝且含50μL甲硫酸新斯的明储备液），剩余3mL推入至采血管A中（EDTA-K2抗凝）。将采血管B立刻离心（10℃、4 000 r·min-1，10min）。并在冰浴条件下，取 100 μL离心得到的血浆样品至含有800μL甲醇的EP管中，涡旋 10min 后离心（10 ℃、12 000 r·min-1，10min）获取上清液，根据“方法B”检测血浆中原始BBA的浓度。采血管A置于室温条件下2 h后离心（10℃、4 000 r·min-1，10min），离心得到血浆样品，根据“方法A”检测血浆中总BBA的浓度。《美国药典》指出，苯佐那酯和BBA的摩尔当量相等[7]，因此，血浆中苯佐那酯的浓度可根据公式（1）计算。随后，采用Win-Nonlin 6.4计算BBA和苯佐那酯的药代动力学参数。并通过WinNonlin 6.4和SPSS 19评价BBA和苯佐那酯的药代动力学特征。

在公式（1）中，C表示浓度；MW表示相对分子质量；MW苯佐那酯=603.74；MWBBA=193.24。

3 结 果

3.1 方法学验证[6]

方法A：此方法选择性良好，分析物和内标间无干扰，且不存在残留问题；在 10.0～10 000 ng·mL-1的范围内，线性关系良好，以BBA与内标峰面积之比为纵坐标（y），以 BBC 质量浓度（c）为横坐标，得典型的线性回归方程为y=0.000 451 5C+0.000 270 4，r为 0.999 1；相对标准偏差（RSD）为-2.0%～1.7%，精密度≤6.0%；内标归一化基质因子为95.6%～100.4%、回收率为86.5%～91.4%；BBA的全血样品在室温条件下放置3 h稳定性良好；血浆样品在室温条件放置18.5 h稳定性良好，-70℃条件下5次冻融循环稳定性良好，-70℃条件下长期冰冻27天、87天稳定性良好；处理后待进样的溶液在自动进样器（8℃）条件下放置8天稳定性良好。

方法B：此方法选择性良好，分析物和内标间无干扰；高浓度样品进样后对下一针样品的检测不产生影响；典型的线性回归方程为y=0.000 658 5C+0.000 190 6，r为 0.999 5；RSD 为-4.1%～2.0%， 精密度≤8.4%；内标归一化基质因子为98.5%～109.0%、回收率为98.7%～100.8%；苯佐那酯存在条件下BBA的全血样品和血浆样品在冰浴条件下放置2 h稳定性良好；苯佐那酯存在条件下BBA的上清液样品在室温条件放置18.2 h稳定性良好，-70℃条件下4次冻融循环稳定性良好，-70℃条件下长期冰冻27天、89天稳定性良好；处理后待进样的溶液在自动进样器（8℃）条件下放置9天稳定性良好。

3.2 药代动力学研究

3.2.1 单次给药药代动力学研究 低 （100mg）、中（200mg）、高（400mg）剂量组受试者单次口服苯佐那酯软胶囊后，血浆中BBA和苯佐那酯的平均血药浓度-时间曲线见图1，主要药代动力学参数见表2、表3。

图1 单次给药后血浆中BBA（A）和苯佐那酯（B）的平均血药浓度-时间曲线

通过SPSS19对不同剂量组的Tmax进行非参数检验，对t1/2，CL/F和Vd/F进行单因素方差分析，结果表明剂量对BBA和苯佐那酯的药代动力学特征均不产生影响（P＞0.05）。通过 WinNonlin 6.4，以幂函数模型法（PK=α×doseβ）对苯佐那酯的 Cmax和 AUC0-10h进行线性关系评价[8]，结果见表4。

3.2.2 多次给药药代动力学研究 中剂量组（200mg）受试者多次口服苯佐那酯软胶囊后，血浆中BBA和苯佐那酯的平均血药浓度-时间曲线见图2，主要药代动力学参数见表2、表3。

通过SPSS19对BBA和苯佐那酯AUC0-τ进行两配对样本t检验，结果表明，多次给药会使BBA和苯佐那酯在体内的暴露量增加。根据蓄积常数公式计算得到 BBA 的 RCmax为 （1.20±0.45），RAUC为（1.10±0.13）； 苯佐那酯的 RCmax为 （1.24±0.57），RAUC为（1.31±0.33）。结果表明，多次给药后BBA和苯佐那酯在体内会产生蓄积[9]。

4 讨 论

基于BBA和苯佐那酯间的量化关系，本研究首次提出了间接测定法，通过测定血浆中BBA的浓度推算出了血浆中苯佐那酯的浓度。获得了BBA及苯佐那酯在体内的经时变化过程，估算了BBA和苯佐那酯的主要药代动力学参数，首次揭示了中国健康受试者口服苯佐那酯软胶囊后体内苯佐那酯及其代谢产物BBA的药代动力学特征。

表2 BBA的主要药代动力学参数（n=12）

表3 苯佐那酯的主要药代动力学参数（n=12）

表4 线性评价结果

图2 多次给药后血浆中BBA（A）和苯佐那酯（B）的平均血药浓度-时间曲线

单次给药试验结果表明，在100～400mg的给药剂量范围内，苯佐那酯不具有线性药代动力学特征。多次给药200mg苯佐那酯软胶囊后，BBA在体内的暴露量约增加9%，苯佐那酯在体内的暴露量约增加25%。且多次给药后BBA和苯佐那酯在体内会产生蓄积。因此，在临床连续用药时需格外关注蓄积对药效的影响。