响应面法优化乌蔹莓的提取工艺*

许倩倩，包贝华，张 丽**，赵学龙，谈瑄忠，李 文南京中医药大学，南京 003；南京市中医院，南京 000

乌蔹莓 Cayratia japonica（Thunb.） Gagnep 为双子叶葡萄科植物，药用部位为乌蔹莓的全草或根，主要功效为清热利湿、解毒消肿[1]。研究报道，乌蔹莓对肛周脓肿、急性扭挫伤、痛风性关节炎、风湿性关节炎等病症具有较好的临床治疗效果[2，3]。现代药理研究表明，其具有抗癌、抗菌、抗凝、增强免疫功能、抗病毒、抗炎、镇痛[3，4]等作用。乌蔹莓中主要含有黄酮类的成分，如木犀草素、芹菜素、槲皮素等[5]。研究表明，木犀草素具有抗炎[6]、抗癌[7]、抗氧化[8]、抗菌[9]等药理作用，与乌蔹莓的临床作用相契合。

乌蔹莓软膏为乌蔹莓单味药方，其临床药效明确，现有的软膏制备工艺为饮片机械取粉，加入基质制备而得。此法药物利用度低，为提高利用率对乌蔹莓原料进行醇提工艺研究，在单因素试验基础上，采用 Box-Behnken Design（BBD）响应面法设计优化试验[10]，以醇提干浸膏得率和木犀草素含量为指标，采用综合评分法，优选乌蔹莓软膏原料的最佳醇提工艺，为其优化制备与开发奠定基础。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

Shimadzu LC-20AB高效液相色谱仪 （日本岛津公司）；电子天平（Mettler Toledo）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9023A）；减压干燥箱（XMTD-8222）上海精宏实验设备有限公司；超声清洗器 （KH-500B，功率500W，频率40Hz，昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q超纯水制备系统。

1.2 药品与试剂

乌蔹莓饮片购自安徽亳州（20170214），经南京中医药大学吴启南教授鉴定确认；木犀草素对照品（纯度99.6%，批号111520-201605，中国食品药品检定研究院）；甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯；超纯水。

2 方 法

2.1 样品提取

取乌蔹莓饮片以粉碎机粉碎，过筛，得最粗粉。取一定量的粉末，置于具塞锥形瓶中，加入一定量的乙醇溶液，加热回流提取2次，过滤，合并滤液并定容。取提取液20mL，干燥，恒重，计算干浸膏得率。

2.2 色谱条件[11]

色谱柱：Agilent 5 HC-C18（2）（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.2%甲酸水（60∶40）；检测波长：360nm；柱温：30℃；流速：0.8mL·min-1；进样量：10μL。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取木犀草素对照品适量，置于100mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，配制成0.009 7mg·mL-1对照品溶液。

2.4 单因素试验

2.4.1 乙醇浓度 称取乌蔹莓饮片粉末5 g，置于具塞锥形瓶中，加8倍量乙醇，提取1 h、共2次，在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%条件下进行考察。计算干浸膏得率，HPLC法测定木犀草素的提取含量，平行2份。下同。

2.4.2 醇倍量 称取乌蔹莓饮片粉末5 g，置于具塞锥形瓶中，加70%乙醇8倍量，提取1 h，共2次，分别在加醇量为 6、8、10、12、14倍条件下进行考察。

2.4.3 提取时间 称取乌蔹莓饮片粉末5 g，置于具塞锥形瓶中，加8倍量70%乙醇，提取2次，分别在提取时间为1、2、3h条件下进行考察。

2.5 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，选取乙醇浓度、醇倍量和提取时间三个因素，采用Design-Expert.V8.0.6软件对这三个因素分别在3个水平上对其提取参数进行优化，以干浸膏得率和木犀草素含量为指标，并根据以下方法计算两个指标的综合评分值[12]：2个指标分别以最高值为1，其余各组以其与最高值比值为得分，综合得分：Z=X×0.5+Y×0.5（X 为各组干浸膏得率的得分，Y为各组木犀草素含量的得分）。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果与分析

3.1.1 乙醇浓度对干浸膏得率和木犀草素含量的影响 由图1可知，随着乙醇浓度的增加，木犀草素含量逐渐增加，而干浸膏得率在乙醇浓度为70%时达到最高值。综合考虑确定BBD实验设计乙醇浓度的水平为60%、70%、80%。

图1 乙醇浓度对干浸膏得率、木犀草素含量的影响

3.1.2 醇倍量对干浸膏得率和木犀草素含量的影响 由图2可知，在醇倍量逐渐增加，其干浸膏得率也逐渐增加；当醇倍量为10～12倍时，木犀草素含量达到高值。结合实验结果并从大生产工艺考虑，确定BBD实验设计的醇倍量水平为8、10、12倍。

图2 醇倍量对干浸膏得率、木犀草素含量的影响

3.1.3 提取时间对干浸膏得率和木犀草素含量的影响 由图3可知，随着提取时间增加，干浸膏得率及木犀草素含量均逐渐增加，故确定BBD实验设计提取时间的水平为 1、2、3 h。

图3 提取时间对干浸膏得率、木犀草素含量的影响

3.2 响应面法优化乌蔹莓醇提工艺

3.2.1 响应面试验设计及结果 在单因素的基础上，利用Box-Behnken设计出三因素三水平共17个试验点的响应面试验，其中12个析因点分别构成三维顶点，5个零点为区域的中心点[13]，因素、水平及编码值见表1；Box-Behnken试验设计及响应值见表2。

表1 Box-Behnken设计的因素和水平

表2 Box-Behnken试验设计及响应值

3.2.2 响应面试验数据分析 采用Design Expert.V8.0.6软件，以醇倍量A、提取时间B、乙醇浓度C为自变量，以双指标综合评分Y为响应值，对表2的数据进行回归拟合，得到方差分析表3，对其数据进行多项式拟合，建立一个回归方程：Y=+0.97+0.062A+0.015B-2.500E-003C+0.020AB+5.000E-003AC+0.030BC-0.035A2-0.040B2-0.066C2。方差分析及回归系数显著性检验结果见表3。

表3 方差分析结果

由表3方差分析结果看出，该响应面回归模型的 F 值为 21.34（P=0.000 3，P＜0.01），表明模型显著，具有良好的拟合性。A、B、C三个因素的影响大小依次为 A＞B＞C，因素 A、A2、B2、C2及 BC 的交互作用对响应值的影响显著，说明各因素与响应值之间并不是简单的线性关系。该模型失拟项F值为1.79（P=0.289 0，P＞0.05），相关系数 R2=0.964 8，表明建立的二次模型成立，该模型在本实验研究范围内有统计学意义。

3.2.3 各因素及其交互作用对干浸膏得率和木犀草素含量的影响 利用Design-Expert.V8.0.6软件进行拟合，直观了解各因素之间两两交互作用对乌蔹莓醇提工艺的影响。由图4可知，提取时间、醇倍量、乙醇浓度3个因素的结果均呈先上升后下降的趋势。其中醇倍量的降幅较小，仅略有降低。图4中显示了两两交互作用的影响结果，左边均为等高线图，不同因素之间的交互关系均为椭圆形，说明两两交互作用均较为显著；右边为三维曲面图，均为山峰形，且曲面坡度均较为陡峭，同样说明交互作用较为显著，尤其B、C交互作用、即提取时间与乙醇浓度交互作用的曲面图最为陡峭，说明交互作用较其他交互作用显著。

图4 各因素交互作用的等高线与响应面图

3.2.4 提取工艺参数的验证 根据软件分析计算，乌蔹莓的最佳醇提工艺为：加醇量12倍，提取时间2.48 h，乙醇浓度71.29%，理论计算综合评分为1.001 56；为方便实验操作，将最佳工艺修正为：加醇量12倍，提取时间2.5 h，乙醇浓度70%。

称取乌蔹莓饮片粉末5g，按照优化的最佳醇提工艺提取，平行3份，得出干浸膏的得率分别为10.42%、10.44%、10.43%，平均得率为 10.43%；木犀草素含量分别为 0.32、0.32、0.32mg·g-1，平均含量为0.32mg·g-1；综合得分为 0.98，与预测值的相对误差为2.2%，证明了回归模型较为准确可靠，优化的醇提工艺具有可重复性和可操作性。

4 讨 论

响应面法（response surface methodology，RSM）是一种综合试验设计和数学建模的优化方法，可有效减少试验次数，与正交试验相比，响应面法可根据二次方程模型分别做出试验因素间交互作用的等高线图和三维立体响应曲面，使实验结果更加直观。BBD法是响应面优化法常用的实验设计方法之一，适用于2～5个因素的优化，在因素相同时，BBD的实验次数更少，更经济[12]。BBD设计法每个因素取3个水平，以-1、0、1编码。其设计表安排以0为中心点，+1、-1分别是立方点相对应的高值和低值。BBD优化求解出的最优工艺水平值不会超出最高值范围，对某些有特殊需要或安全要求的实验尤为适用。

乌蔹莓软膏在临床长期应用于肛周脓肿、痛风性关节炎及其他消肿止痛抗炎疾病，但现有工艺采用直接打粉入药的方式，处理工艺粗糙，使用舒适度较差，药物利用度低，且卫生学很难达标，反复灭菌又易致药效成分不稳定或损失，导致疗效下降。本实验对乌蔹莓粉末的醇提工艺进行研究，并采用BBD设计方法优选乌蔹莓软膏原料的最佳醇提工艺：加醇量12倍，提取时间2.5 h，乙醇浓度70%。希望通过优化的提取方法改善以前工艺所存在的问题。

对乌蔹莓软膏原料的醇提工艺进行优选，改变其原打粉工艺，提高药材的利用率，后期将进行药效学研究、优选软膏剂的制剂工艺并对乌蔹莓软膏的质控标准进行研究，以期提高乌蔹莓软膏的质量。