HPLC法同时测定丁细牙痛胶囊中细辛脂素、原儿茶醛和原儿茶酸的含量

葛玉松

盐城市食品药品监督检验中心，江苏盐城 224000

丁细牙痛胶囊处方由丁香叶和细辛组成，具有清热解毒、疏风止痛功能；用于治疗风火牙疼，急性牙髓炎、急性根尖炎等症[1]。本方中丁香叶中所含原儿茶酸、原儿茶醛具有广谱抗菌消炎作用[2]；细辛所含细辛脂素具有祛风止痛功效，可用于治疗牙痛[3]。因此可将细辛脂素、原儿茶酸、原儿茶醛作为本品含量测定指标。现行质量标准[4]采用供试品在酸性条件下与亚硝钠-钼酸钠反应，以原儿茶酸为对照，紫外分光光度法测定丁香叶内的含量，此方法灵敏度及专属性较差。本研究参照有关文献[5-7]，采用高效液相色谱法同时测定丁细牙痛胶囊中细辛脂素、原儿茶醛、原儿茶酸的含量，以期更好地控制该品的质量。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

岛津LC-20A高效液相色谱仪 （岛津企业管理中国有限公司）；XS205DU电子天平 （梅特勒-特利多电子有限公司）；XP26电子天平 （瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500型超声波清洗器 （江苏昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

丁细牙痛胶囊 （规格0.45 g，批号20170903、20180312、20180907，深圳市泰康制药有限公司）；细辛脂素对照品 （纯度100.0%，批号111889-201504）、原儿茶酸 （纯度99.9%，批号110809-201205）、原儿茶醛 （纯度99.3%，批号110810-201608），均购自中国食品药品检定研究院。

乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯；去离子水自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Capcell Pak MG Ⅱ C18（4.6mm×150mm，5μm）；流动相：乙腈-1%冰醋酸溶液；检测波长：287nm；柱温：35℃；流速：1mL·min-1；进样量：10μL。流动相按表1进行梯度洗脱。

表1 乙腈-1%冰醋酸溶液梯度洗脱表

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取细辛脂素对照品15.25mg、原儿茶酸对照品20.90mg、原儿茶醛对照品10.59mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液。精密量取1mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取本品10粒内容物，混合均匀，精密称取0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理45min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 专属性试验 按“2.2.2”节方法的用量比例分别配制阴性对照溶液、除丁香叶阴性对照溶液、除细辛阴性对照溶液。分别取对照品混合溶液、供试品溶液、阴性对照溶液、除丁香叶阴性对照溶液及除细辛阴性对照溶液，照“2.1”项下色谱条件测定。结果表明，主成分峰分离度良好，主成分与杂质能得到很好分离，原辅料均无干扰。见图1。

图1 专属性试验液相色谱图

2.2.4 线性范围考察 精密吸取对照品贮备液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL 置 10mL 量瓶中， 加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取5μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。细辛脂素的回归方程：Y=1.27×106X+789.25（r=0.999 9）；原儿茶酸的回归方程：Y=8.25×105X-214.23 （r=0.999 9）； 原儿茶醛的回归方程：Y=1.84×106X-42.99（r=0.999 9）。

结果表明，细辛脂素在0.015 25～0.152 5mg·mL-1、原儿茶酸在 0.020 88～0.208 8mg·mL-1、原儿茶醛在0.010 52～0.1052mg·mL-1的范围内，与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5 进样精密度试验 取同一批号（20170903）供试品溶液重复进样6次，记录色谱图。结果细辛脂素峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.46%，原儿茶酸峰面积RSD为0.47%，原儿茶醛峰面积RSD为0.51%。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液 10μL， 分别在 0、2、4、8、12、24h 各进样一次，测定峰面积，细辛脂素、原儿茶酸、原儿茶醛的RSD分别为1.36%、1.13%、1.18%。

2.2.7 重复性试验 取同一批号（20170903）供试品，按“2.2.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定，结果细辛脂素平均含量为2.74mg/粒，RSD为1.67%；原儿茶酸平均含量为4.71mg/粒，RSD为1.59%；原儿茶醛平均含量为2.56mg/粒，RSD 为1.43%。

2.2.8 加样回收率试验 取同一批己知含量供试品（平均装量 0.4551 g，批号 20170903）6 份，每份约0.3 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密加入一定量的3种成分的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别测定细辛脂素、原儿茶酸、原儿茶醛的含量，并计算回收率，结果见表2。

2.2.9 样品测定 取3批次样品，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，分别测定含量，并按现行标准[4]采用紫外分光光度法测定原儿茶酸的含量，以作比较，结果见表3。

3 讨 论

实验中对对照品混合溶液进行光谱扫描，发现细辛酯素最大吸收波长为287 nm，原儿茶醛最大吸收波长为313nm、278nm，原儿茶酸最大吸收波长为294 nm、259nm；根据样品中3个主成分的含量、峰面积及其他物质的影响，选择检测波长为287 nm。

实验中参考《中国药典》细辛项下细辛脂素[4]的含量测定方法，采用乙腈-水作为流动相，发现原儿茶酸和原儿茶醛峰形严重拖尾。而采用乙腈-1%冰醋酸作为流动相，峰形较好，理论板数也较高，阴性无干扰。因原儿茶醛和细辛脂素保留时间相距较大，且两个对照品峰间杂质较少，减少试验时间，并获得较好的分离效果，因此流动相采用梯度洗脱法。

表2 加样回收率结果（n=6）

表3 样品测定结果（n=2）

在前处理的过程中，分别用甲醇、70%乙醇和甲醇-1%冰醋酸（70∶30）处理样品，结果甲醇处理后得到的样品杂质最少，有效成分也提取完全。

将本研究方法测得的原儿茶酸含量与原标准含量比较，发现本法原儿茶酸含量明显低于原标准，而RSD明显好于原标准，这是因为紫外分光光度法专属性较差，操作繁琐，误差较大，并不能真实反映供试品中原儿茶酸的含量。