酶解法制备豆粕水解肽工艺优化

许 腾 卢 聪 范海茹 王东晖 李淑英 范 蓓 王 艳 王凤忠

(中国农业科学院农产品加工研究所,北京 100193)

豆粕是大豆油脂最主要的加工副产品,其蛋白质含量为45%～55%,且80%以上为水溶性蛋白质[1]。但通常被用作饲料,少部分用于发酵食品的加工[2],造成了蛋白质资源的极大浪费。 研究表明,豆粕中的蛋白质酶解制备的低肽混合物,即大豆功能性水解肽,具有良好的生物活性[3-4],尤其是分子量小于1 000 Da 的水解肽,具备降血压[5-6]、降胆固醇[7]、抗氧化[8-9]、促进胃肠道吸收[10]、调节血糖浓度[11]等功效。因此,将豆粕用于生产小分子功能性水解肽,既降低了资源浪费,也极大提高了豆粕的附加值。

大豆水解肽的制备方法主要有酸水解法[12]、酶水解法[13-15]和生物发酵法[16-17]。 我国大豆肽的工业化生产主要采用酶水解法。 与其他方法相比,酶水解作用条件温和,易于控制水解程度,能很好地保存氨基酸的营养价值。 但酶解法也存在一定的问题,如在蛋白质酶解过程中,由于肽链断开,肽链中的疏水性氨基酸暴露,使水解产物多产生苦味[18]。

目前,豆粕酶解制备小分子肽的研究主要集中在豆粕的复合酶解与生物活性肽制备等方面[19]。 国内的研究者主要通过对碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶等复合酶开展豆粕制备低苦味多肽的酶解工艺研究[20-24],而有关结合智能感官评价技术评价多个酶组合分步酶解豆粕制备水解肽的研究尚鲜见报道。 在前人研究的基础上,本研究针对豆粕酶解蛋白酶的选择、酶解工艺参数、水解液的脱苦等方面进行探讨及优化,以期获取制备苦味低且生物活性高的豆粕水解肽的最佳酶解方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低温豆粕购自中粮集团；碱性丝氨酸蛋白酶(200 U·mg-1)购自北京奥博星生物技术有限公司；木瓜蛋白酶(100 U·mg-1)购自沃凯国药集团；中性蛋白酶(100 U·mg-1)、菠萝蛋白酶(600 U·mg-1)购自上海源叶生物有限公司；复合蛋白酶(120 U·mg-1)、脱苦蛋白酶(200 U·mg-1)购自北京伊诺凯科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

AL 204 型精密电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HH-1 型数显恒温水浴锅,江苏荣华有限公司；testo 206-1 型手持pH 计,德国德图仪器有限公司；LYNX 6000 型高速冷冻离心机,美国Thermo Scientific 公司；UDK159 型全自动凯氏定氮仪,意大利VELP 公司；Metrohm 916 Ti-Touch 型全自动电位滴定仪,瑞士万通中国有限公司；L-8900 型全自动氨基酸分析仪,日本日立公司；ASTREE 型电子舌,法国阿尔法莫斯公司；LC98Ⅱ型高效液相色谱仪[SB-404-SE 7μ/4.6×250 mm/排阻限1 000 000(葡聚糖)],北京温分分析仪器技术开发有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 氨基酸含量的测定 参考文献[25-26]的方法。 取1 g 豆粕样品于消化管中,加入10 mL 6 mol·L-1HCl,然后置于110℃烘箱中水解22 h,再经过滤、氮吹、稀释,取适量上机检测。

1.3.2 总蛋白含量的测定 参考徐新娟等[27]的方法。 取1 g 豆粕样品进行消化,使用全自动凯氏定氮仪测定总蛋白含量。

1.3.3 酶解试验 称取7 g 粉碎后的豆粕粉于锥形瓶中,加适量去离子水,然后置于90℃水浴锅预处理10 min 后冷却。 将水浴锅调节至蛋白酶1(表1)最适温度,向锥形瓶中加入2 mol·L-1HCL 或2 mol·L-1NaOH调节pH 值至蛋白酶1 最适pH 值,加入0.28 g 蛋白酶1,置于水浴锅水解一定时间。 蛋白酶1 酶解完成后,将水浴锅调节至蛋白蛋白酶2(表1)最适温度,pH 值调节至蛋白酶2 最适pH 值,然后加入0.28 g 蛋白酶1 水解一定时间。 同理完成蛋白酶3(组合7)的水解。 水解试验全部完成后,调节pH 值使未水解的蛋白沉淀,沸水浴条件下高温灭活,然后迅速冷却至室温,高速离心(10 000 r·min-1,20 min)后,取上清液定容至100 mL 供分析用,部分冻干供后期分析。

表1 复合酶的组合Table1 Combination of complex enzymes

1.3.4 蛋白质转化率的测定 取适量蛋白水解液,加入10 mL 10%三氯乙酸(trichloroacetic acid solution,TCA),混匀后放置30 min,然后4 000 r·min-1离心10 min,保留上清液,采用凯氏定氮法测定蛋白质含量,按照公式计算蛋白质转化率：

式中,X为蛋白质转化率；P 为酶解液中溶于10%三氯乙酸的氮含量；P0为未酶解前溶于10%三氯乙酸的氮含量；S0为底物蛋白质的总氮含量。

1.3.5 水解度的测定 参考肖凯军等[34]的方法。 豆粕完全水解液：称取一定量豆粕于烧杯中,加6 mol·L-1盐酸密封后于烘箱中110～120℃水解24 h,经布氏漏斗过滤后吸取5 mL 上清液,采用凯氏定氮法测定豆粕中蛋白质含量。 吸取适量豆粕完全水解液,使得其蛋白含量为0.4 g,调节pH 值至7.5～8.0,然后用全自动电位滴定仪测定豆粕完全水解液的耗碱量。

样品水解液：称取适量的各组酶解后的样品溶液,经凯氏定氮法测定样品蛋白质含量后,吸取适量酶解液使其蛋白含量为0.4 g,调节pH 值至7.5 ～8.0,然后用全自动电位滴定仪测定样品水解液的耗碱量。 同理测得原料豆粕的耗碱量。 按照公式计算水解度：

式中,A 为样品水解液耗碱量；B 为原料豆粕的耗碱量；C 为完全水解液的耗碱量。 这里需保证所取原料、样品水解液及完全水解液中的蛋白含量一致。

1.3.6 口感测定 分别取水解肽溶液的冻干粉末0.1 g,加入100 mL 超纯水,溶解后上机检测。

1.3.7 水解肽分子量分布 参考鲁红[35]的方法。 分别取20 mg 1.3.3 中制备的水解肽溶液的冻干粉末,流动相为水溶液,色谱柱为SHODEX SB-801HQ 凝胶柱,应用凝胶渗透色谱仪测定水解肽的分子量分布。

2 结果与分析

2.1 豆粕中氨基酸组分分析

经检测分析,豆粕总蛋白含量为50.96%。 由图1可知,豆粕中共检出15 种氨基酸,含量总和为51.09%。 其中,包含7 种必需氨基酸：赖氨酸(Lys)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)及蛋氨酸(Met),而蛋氨酸(Met)是豆粕的限制性氨基酸。 根据FAO/WHO 推荐豆粕中标准氨基酸含量[36],经计算其氨基酸评分为

图1 豆粕中氨基酸组分及含量Fig.1 Composition and content of amino acid from soybean meal

56.77%(理想蛋白质的必需氨基酸AAS 值应达总量的40%),表明豆粕的氨基酸组成具有必需氨基酸比例平衡、含量丰富的特点,具有较高的营养价值。

2.2 酶解试验结果

在豆粕蛋白酶解前进行加热处理,使豆粕蛋白紧密的内部结构松散,暴露酶的作用位点,有利于蛋白酶的结合。 转化率越高表示试验的可行性越高,水解度可以反映水解液中大豆蛋白肽链的肽键被酶切割的程度。 由表2可知,第7 组碱性+中性+脱苦蛋白酶组合获取的豆粕水解肽蛋白质转化率和水解度均最高,分别达到69.19%、16.36%,表明选用该酶解组合水解蛋白更彻底。

表2 豆粕酶解转化率、水解度结果Table2 Results of enzymolysis conversion rate and hydrolysis degree of hydrolyzed peptides from soybean meal

2.3 豆粕水解肽差异显著性分析

图2 豆粕水解肽显著性差异分析Fig.2 Analysis on the significant difference of hydrolyzed peptides from soybean meal

将各组得到的水解肽进行主成分分析(principal component analysis,PCA)。 由图2可知,横向维度第一主成分(PC1)分析显示,豆粕完全水解肽与各试验组酶解得到的豆粕水解肽差异性显著；纵向维度第二主成分(PC2)分析显示,各试验组中豆粕碱性蛋白酶水解肽、碱性+中性+脱苦蛋白酶水解肽与其他试验组水解肽分离明显,说明单酶、两种酶组合及三种酶组合产生的水解肽差异性显著。

2.4 豆粕水解肽鲜咸结果分析

由图3可知,与其他酶组合相比,碱性+中性+脱苦蛋白酶组水解肽的鲜味与咸味两者比例之和在12以上,鲜、咸味较强,可掩盖一定苦味,综合风味较佳。

图3 豆粕水解肽鲜咸分析Fig.3 Analysis of umami and salty taste of hydrolyzed peptides from soybean meal

2.5 豆粕水解肽分子量分析

由图4可知,7 种酶组合水解液分子量分布在1 000 Da以下分别为碱性蛋白酶+木瓜蛋白酶解水解肽(83.2%)、碱性蛋白酶+菠萝蛋白酶解水解肽(90.1%)、 碱性蛋白酶+ 脱苦蛋白酶解水解肽(90.0%)、 碱性蛋白酶+ 复合蛋白酶解水解肽(91.3%)、碱性蛋白酶水解肽(88.7%)、碱性蛋白酶+中性蛋白酶解水解肽(89.5%)、碱性蛋白酶+脱苦蛋白酶+中性蛋白酶解(89.8%),且水解肽占比均在80%以上,表明7 种组合酶解条件对豆粕的酶解均较彻底。

3 讨论

图4 豆粕水解肽中主要的分子量分布段及其所占百分比Fig.4 Main molecular weight distribution segments and their percentages in each group of hydrolyzed peptides

酶解豆粕可以产生具有特殊生物活性的小分子肽,且在一定程度上可消除豆粕的不良风味及抗营养因子[37],从而提高豆粕的营养价值和利用价值。 转化率、水解度通常作为评价蛋白质酶解程度的指标,以此确定最佳酶解工艺条件,可得到小分子肽得率较高的水解产品。 张亚丽等[38]通过胰蛋白酶对变性豆粕进行水解,正交试验法优化获得最佳酶解条件下,蛋白质转化率为69.34%；黄雅燕等[39]以转化率和水解度为指标,利用正交试验优化碱性蛋白酶酶解工艺,蛋白质转化率达75.73%,水解度为49.30%,大豆多肽相对分子质量分布主要集中在5 000 Da 以下,占比达80.21%。 近年来越来越多的研究者开始利用复合酶法水解蛋白质,以获得蛋白质转化率、水解度更高的酶解工艺和酶组合。 其中,张晓峰等[24]选择碱性蛋白酶和风味蛋白酶对豆粕进行优化酶解,将转化率提高至72.3%；李景等[40]将碱性蛋白酶分别与中性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶进行组合,发现用碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合进行水解豆粕时,水解度最高,可达到46.83%,并测得水解产物的血管紧张素转换酶抑制率可达到72.21%。 但豆粕水解肽通常有较强的苦味[41],影响其在食品中的应用,只考虑转化率和水解度已不能满足产业需求。 通过感官评价来优化酶解工艺,制备口感好的生物活性肽,已成为研究者们新的探索方向[42]。 王慧云等[20]结合感官评价开展了中性蛋白酶和复合蛋白酶复配酶解豆粕的工艺研究,获得了鲜味浓郁的呈味肽；林洋等[21]以豆粕为发酵原料,利用碱性、中性蛋白酶和胰蛋白酶进行复配酶解豆粕,并利用盐酸奎宁的苦味对比确定水解液的苦味值,获得了低苦味的小肽混合物,其分子量≤1 000 Da 的水解肽可达74.67%。 本试验中,碱性+中性+脱苦蛋白酶组合获得的豆粕水解肽蛋白质转化率和水解度分别达到69.19%、16.36%,获得的低苦味小肽混合物分子量≤1 000 Da 的水解肽高达89.8%。

研究表明,酶切位点在疏水氨基酸和芳香族氨基酸羧基端的蛋白酶,特别是酶切位点为Tyr、Pro、Trp、Phe 和Leu 羧基端的蛋白酶是制备较高生物活性肽的理想水解酶[43]。 在此基础上,本试验选用同时含有内切酶和外切酶的复合酶对豆粕进行酶解,对酶解后的水解肽进行分子量分布测定,并首次结合智能感官评价系统,结果显示,7 个酶组合豆粕水解肽中分子量在1 000 Da 以下的占比均在80%以上,其中碱性+中性+脱苦蛋白酶组合的分子量≤1 000 Da 的水解肽可达89.8%,且该组合所得水解肽的口感与其他组合具有显著差异,鲜、咸味明显,苦味能够被有效遮盖。

4 结论

本试验通过比较单酶、双酶及三酶等酶组合对豆粕的酶解效果,优化豆粕水解肽的制备工艺条件,结果表明,碱性蛋白酶+脱苦蛋白酶+中性蛋白酶复合酶制备的水解肽的理化性质及口感更优。 本研究首次结合智能感官评价技术及多变量统计方法直观对比复合酶解方案的综合效果,获得了制备苦味低且生物活性高的豆粕水解肽的方法,且工艺简单,符合实际生产要求,为豆粕资源的开发和低苦味肽的研究提供了数据支持与参考。