黑牛肝菌多糖结构及体外抗肿瘤活性研究

唐 贤，丁 祥，朱 淼，宋志强，侯怡铃*

（1.西华师范大学 生命科学学院，西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川 南充 637009；2.西华师范大学 环境科学与工程学院，四川 南充 637009）

黑牛肝菌又称铜色牛肝菌（Boletus aereus），属牛肝菌科牛肝菌属，主要分布于四川、贵州、云南、欧洲等地[1]，高蛋白、低脂肪、低热量，味道鲜美，营养价值高，具有极高的商业价值[2]，近年，其多糖类成分的研究引起了人们的关注。目前对于黑牛肝菌多糖的研究主要集中于其分离纯化、抗氧化及降血脂活性[4-6]，对黑牛肝菌多糖的体外抗肿瘤活性研究未见报道。本文参考文献方法[7]提取纯化黑牛肝菌多糖，并采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、核磁共振氢谱（1H NMR）技术表征其结构，并研究其对肿瘤细胞增殖的影响，以冀为黑牛肝菌多糖的深入研究提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

TU-1901/1900 系列傅立叶红外光谱仪（Thermo Fisher Scientific）；BPN-80CH（UV）CO2细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific）；96孔板（Corning）； SE-CJ-1F型超净工作台 （苏州安泰）；酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；旋转蒸发仪RE-2000A（上海亚荣生化仪器厂）；水浴锅（上海光地）。

1.2 材料

黑牛肝菌（Boletus aereus）子实体采集于四川省阿坝藏族羌族自治州小金县，洗净，置60 ℃烘箱烘干，保存于西南野生动植物资源保护教育部重点实验室。

1.3 试剂

DEAE-52纤维素柱（上海源叶生物）；透析袋（截留分子量≥7000 Da）（Biosharp 生物科技）；葡聚糖凝胶Sephadex G-200（Solarbio）；NaOH（天津津北）； NaCl，浓硫酸，浓盐酸（成都科隆）；苯酚（四川航嘉）；无水乙醇[上纬精细化工（上海）公司]，以上试剂均为分析纯。RPMI-1640 培养基，双抗，胎牛血清（Thermo Fisher Scientific）；脂多糖（LPS，Sigma）；细胞计数试剂盒（CCK-8试剂盒）[博升生物科技（上海）]。

2 方法

2.1 黑牛肝菌多糖提取与纯化

精确称取黑牛肝菌子实体100 g，置60 ℃烘箱烘干，粉碎，细粉经热水（96 ℃）浸提，浓缩，乙醇沉淀（1:4），Sevag 法脱蛋白，60 ℃低温干燥等步骤后，得粗多糖。将粗多糖加蒸馏水溶解，取5 ml加入活化平衡好的DEAE-52纤维素柱，用0.01 mol/L氯化钠溶液过柱，流速为5 ml/min，收集500 ml洗脱液。洗脱多糖采用硫酸-苯酚法测定。将洗脱液浓缩至5 ml，置于透析袋中，并用蒸馏水持续透析2 d，每隔8 h换一次蒸馏水，透析后洗脱液冷冻干燥[8]，得到纯化后的黑牛肝菌多糖（BA-1）。

2.2 BA-1结构初步表征

称取BA-1 3 mg，将其与适量干燥的 KBr研磨混匀后压片，进行FT-IR分析，波数范围4000～400 cm-1。称取BA-1 10 mg，溶于600 μl D2O，并在核磁共振仪上记录1H NMR数据。

2.3 BA-1对3种肿瘤细胞增殖的影响

采用细胞计数试剂盒（CCK-8法）测定BA-1对MFC细胞，CT26.WT细胞和S180细胞增殖的抑制作用。选取处于对数生长期的细胞，细胞计数板计数后，用1640完全培养液将细胞悬液稀释至1×105CFU/ml，吸取细胞悬液100 μl至96孔板，置CO2培养箱中培养24 h。24 h后，加入不同质量浓度的BA-1溶液（最终质量浓度为2.5，5，10，20，25 μg/ml）100 μl；阳性对照组每孔加入 LPS溶液（最终质量浓度5 μg/ml）100 μl，空白组每孔加入完全培养液100 μl。于CO2培养箱中培养24 h，分别向每孔加入CCK-8 5 μl，置CO2培养箱中孵育3 h，酶标仪（450 nm）检测。按以下公式计算细胞抑制率。

式中，P为细胞抑制率；A1为空白组平均吸光度值；A2为实验组平均吸光度值。

3 结果与分析

3.1 FT-IR分析

采用OMNIC 8.2软件处理分析BA-1的FT-IR光谱。BA-1的FT-IR光谱图在4000～400 cm-1波数范围内有典型的吸收峰（见图1）：3700～3100 cm-1范围内的宽吸收峰为O-H伸缩振动，3010～2850 cm-1范围内的吸收峰为-C-H， -CH2，-CH3伸缩振动，1800～1600 cm-1为 C=O，C=C伸缩振动峰，1200～1000 cm-1为糖类 C-O伸缩振动峰，620.41 cm-1的峰被指定为 C-H伸缩振动峰。FT-IR数据显示，BA-1的多糖特征峰明显，无其他杂质峰，为均一多糖。

图1 黑牛肝菌多糖FT-IR图谱

3.2 1H NMR分析

采用MestReNova软件处理BA-1的1H NMR图谱，见图2。δ4.70和δ4.67分别为水和D2O的氢信号。BA-1的1H NMR（400 MHz）波谱分为两部分：（1）异头氢区，δ5.90～4.30；（2）环质子区，δ4.40～δ3.00[9]。BA-1有4个异头氢，δ值分别为5.02，4.99，4.98，4.91，一般认为吡喃糖残基的α构型异头氢的δ＞5.00，β构型异头氢的δ＜5.00[10]。这表明BA-1至少由4个单糖组成，且不仅含α构型吡喃糖，还可能含β构型吡喃糖。

图2 黑牛肝菌多糖的1H NMR图谱

3.3 黑牛肝菌多糖对MFC细胞增殖的抑制作用

MFC细胞是小鼠胃癌细胞系，贴壁生长。用不同质量浓度的黑牛肝菌多糖溶液刺激MFC细胞，结果见图3。与空白组相比，LPS可极显著抑制MFC细胞增殖（P＜0.01）；BA-1浓度为5～20 μg/ml时可在一定程度上抑制MFC细胞增殖。与空白组相比，当BA-1浓度为10，15 μg/ml时，对MFC细胞有极显著抑制作用（P＜0.01）；BA-1浓度为20，25 μg/ml时，能显著抑制MFC细胞增殖（P＜0.05），BA-1浓度为15 μg/ml时对MFC细胞的增殖抑制效果最为明显，抑制率为30.68 %。

图3 黑牛肝菌多糖对MFC细胞增殖的抑制作用

3.4 黑牛肝菌多糖对S180细胞增殖的抑制作用

S180细胞为小鼠 Ehrlich 腹水肿瘤细胞，以半悬浮生长。用不同质量浓度的黑牛肝菌多糖溶液刺激S180细胞（见图4）。与空白组相比，LPS能极显著抑制S180细胞增殖（P＜0.01）；BA-1浓度为2.5～25 μg/ml时，对S180细胞增殖有极显著的抑制作用（P＜0.01），BA-1浓度为15 μg/ml时对S180细胞的增殖抑制效果最为明显，抑制率为32.68 %。

图4 黑牛肝菌多糖对S180细胞增殖的抑制作用

3.5 BA-1对CT26.WT细胞增殖的抑制作用

CT26.WT细胞为小鼠结肠癌细胞，贴壁生长。用不同浓度的BA-1溶液刺激CT26.WT细胞，结果见图5。与空白组相比，LPS 能显著抑制CT26.WT细胞增殖（P＜0.05）；BA-1浓度为2.5～20 μg/ml时，均能抑制CT26.WT细胞增殖（P＜0.01），BA-1浓度为15 μg/ml时对CT26.WT细胞的增殖抑制效果最为明显，抑制率为38.90 %。

图5 黑牛肝菌多糖对CT26.WT细胞增殖的抑制作用

4 结论

本文以四川省小金县野生黑牛肝菌为研究对象，采用热水浸提法、DEAE-52 纤维素柱层析法等分离纯化得到黑牛肝菌多糖BA-1。采用FT-IR、1H NMR测定BA-1结构，FT-IR分析显示有明显的多糖结构特征吸收峰，1H NMR图谱显示BA-1至少由4个单糖组成。

用不同浓度的黑牛肝菌多糖BA-1分别刺激MFC细胞、CT26.WT细胞和S180细胞，探究BA-1对肿瘤细胞活性的调节。结果显示，与空白组相比，BA-1能在一定程度上抑制MFC细胞、CT26.WT细胞和 S180细胞增殖，BA-1浓度为15 μg/ml时对MFC细胞、CT26.WT细胞和S180细胞的增殖抑制效果最为明显，分别为30.68 %，32.68 %和38.90 %。

综上，在体外实验中，黑牛肝菌多糖BA-1在一定程度上抑制MFC、 CT26.WT和S180 3种肿瘤细胞的增殖。BA-1是一类大分子物质，其结构鉴定还需进一步研究。本文为后续BA-1的结构鉴定、生物活性研究提供了一定的科学依据。