香砂养胃丸（水丸）的特征图谱研究

程雅婷，王晓云，王学涛*，王艳博，刘凯娜，张上上，杨新宇，郑 斓

（1.秦皇岛市食品药品检验中心，秦皇岛 066000；2.正大青春宝药业有限公司，浙江 杭州 310000）

香砂养胃丸为纳入我国基本医疗保险目录的甲类非处方药，处方由木香、砂仁、白术、陈皮、茯苓、制半夏、醋香附、炒枳实、豆蔻（去壳）、姜厚朴、广藿香、甘草、生姜、大枣十四味药组成，具有温中和胃的功效[1]。中药成分甚多、体系复杂，测定一种或多种指标性成分难以确保其质量。与传统中药鉴定方法比较，特征图谱法在药物鉴定过程不会受到药品形态的限制，可大幅提高检测的稳定性、精准度、可靠性[2]，近年，已经越来越多的应用于中药材及中成药的质量控制[3-10]。市售香砂养胃丸质量差异显著[11]，目前的检测方法研究多基于其中一种或两种饮片、成分的质量控制，未能形成系统[12-17]。笔者采用高效液相色谱建立了香砂养胃丸的特征图谱，确定了12个特征峰的相对保留时间，指认了橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚、α-香附酮等4个特征峰，方法快速、准确，灵敏度高，可用于香砂养胃丸的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津），Labsolution工作站，AG-135电子分析天平（瑞士Mettler Toledo），Bandelin DL-1028H超声波清洗器（德国Bandelin）。

1.2 试药与试剂

橙皮苷对照品（批号：110721-201014，含量95.1 %），木香烃内酯对照品（批号：111524-201710，含量99.5 %），和厚朴酚对照品（批号：111730-201614，含量99.3 %），厚朴酚对照品（批号：111729-201513，含量98.8 %），α-香附酮对照品（批号：110748-201714，含量99.4 %）均购于中国食品药品检定研究院。木香、陈皮、厚朴、香附、白术药材、藿香、甘草药材、枳实等药材由生产厂家提供，经主任中药师邸立杰鉴定为正品。

乙腈（MREDA，USA，色谱纯），水为纯净水（娃哈哈纯净水）。

18批香砂养胃丸（水丸）样品。河南省康华药业股份有限公司生产，批号16120802（S1）、批号16122901（S2）、批号17030701（S3），河南明善堂药业有限公司生产，批号161209（S4）、批号161212（S5），湖北瑞华制药有限责任公司生产，批号161220（S6），山西旺龙神农药业有限公司生产，批号20151204（S7）、批号20161101（S8），民生集团药业有限公司生产，批号161101（S9），保定中药制药有限公司生产，批号160302（S10），北京御生堂集团石家庄制药有限公司生产，批号16034008（S11），江苏平光信谊（焦作）中药有限公司生产，批号160103（S12）、批号161102（S13），河北万岁药业有限公司生产，批号161002（S14），陕西香菊药业集团有限公司生产，批号170301（S15），药都制药集团股份有限公司生产，批号161201 （S16）、批号170401（S17），石药集团河北永丰药业有限公司生产，批号10516080514（S18）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Wondasil C18-WR色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇（A）-水（B）为流动相B，按表1程序进行梯度洗脱；流速1.0 ml/min；检测波长254 nm；柱温30 ℃；进样量20 μl。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别取橙皮苷、木香烃内酯、和厚朴酚、厚朴酚、α-香附酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml各含橙皮苷620 μg/ml、木香烃内酯52.74 μg/ml、厚朴酚51.52 μg/ml、和厚朴酚32.15 μg/ml、α-香附酮0.75 μg/ml的混合溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品约2 g，研碎，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，超声处理（功率600 W，频率35 kHz）30 min，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 对照药材溶液 取处方中药材适量，精密称定，分别按2.2.2项方法操作，即得。

3 HPLC特征图谱的建立

3.1 精密度考察

取同一批样品（S1），按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件连续进样5次，记录色谱图，以厚朴酚为参比峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD值均小于3 %，相对保留时间的RSD均小于2 %，表明仪器精密度良好。

3.2 稳定性考察

吸取同一供试品溶液（S1），分别在0，4，8，12，24 h进样，记录色谱图，以厚朴酚为参比峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD值均小于3 %，相对保留时间的RSD均小于2 %。表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.3 重复性考察

取同一批样品（S1）6份，按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件进行测定，记录色谱图，以厚朴酚为参比峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD值均小于3 %，相对保留时间的RSD均小于2 %。表明方法重复性良好。

3.4 特征图谱的建立及共有特征峰的归属

3.4.1 特征峰的确定及指认 取香砂养胃丸（水丸）18批（S1～S18），按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件进行测定。供试品色谱中，共确定12个特征峰。经与混合对照品及对照药材色谱峰比对分析，可指认出：峰1来源于木香，峰6来源于陈皮，峰8、11来源于厚朴，峰9和峰12源自于醋香附，峰10源自于白术，峰2为藿香和甘草共同所有，3、4、5号峰为陈皮和枳实共同贡献，峰7为木香和陈皮共同贡献；可以确定的化合物有：4号峰为橙皮苷，8号峰为和厚朴酚，11号峰为厚朴酚，12号峰为α-香附酮。色谱图见图1。

图1 混合对照品、样品、对照药材溶液和溶剂HPLC图

3.4.2 特征图谱共有模式的建立及分析 采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版）进行分析，以S1为参照图谱，时间窗宽度设置为0.2 min，经全谱匹配共确立12个共有峰，并生成对照指纹图谱（平均值法），建立香砂养胃丸特征图谱共有模式，见图2。在12个共有峰中，峰11（厚朴酚）与相邻峰分离完全，对称性好，峰面积适中，故设定为参照峰。计算各特征峰相对于参照峰的相对保留时间，结果18批样品中各特征峰的相对保留时间均在规定值的±5 %之内：0.107 （峰1），0.386 （峰2），0.419（峰3），0.443 （峰4），0.539 （峰5），0.780 （峰6），0.805 （峰7），0.889 （峰8），0.902 （峰9），0.927 （峰10），1.000 （峰11，厚朴酚，S），1.046 （峰12）。共有峰相对保留时间、相对峰面积及归属详见表2～表4。

图2 18批香砂养胃丸特征图谱共有模式（S1～S18）和对照指纹图谱

表2 18批样品共有峰相对保留时间及峰归属

表3 18批样品（S1～S18）共有峰相对保留时间

表4 18批样品（S1～S18）共有峰相对峰面积

3.4.3 指纹图谱相似度分析 在特征图谱共有模式下，计算18批样品相对于对照指纹图谱的相似度（R），结果均大于0.90，表明各厂家间制剂工艺较稳定，各样品一致性较好，见表5。

表5 18批样品（S1～S18）指纹图谱相似度分析

4 讨论

4.1 提取溶剂的选择

香砂养胃丸（水丸）处方由14味中药饮片组成，成分复杂，为尽可能多提取出各组分，先后考察了甲醇、甲醇-水（50:50）为提取溶剂，发现各组分在甲醇中含量更高，故选用甲醇为提取溶剂。

4.2 提取方法的选择

考虑到处方中木香、砂仁、豆蔻等有效成分均为挥发性成分，受热易挥发而造成损失，故采用超声提取，并对超声时间进行考察，最终选用超声处理30 min为提取方法。

4.3 检测波长的选择

本试验探索初期采用二极管阵列检测器对200～400 nm波长范围进行光谱扫描，并对记录的光谱图像进行筛选，最终发现在254 nm波长时，基线稳定，各特征峰的峰形较好，峰高适宜，故选择254 nm作为检测波长。

4.4 耐用性考察

4.4.1 色谱柱耐用性考察 考察了Shim-pack VP-ODS色谱柱、Wondasil C18-WR色谱柱、Inertsil ODS-SP、Zorbax SB-C18色谱柱及Boston Green ODS色谱柱（规格均为4.6 mm×250 mm，粒径5 μm），发现不同色谱柱在相同条件下的液相色谱图有所差异。岛津品牌的色谱柱如Shim-pack VP-ODS、Wondasil C18-WR、Inertsil ODS-SP均能满足试验要求，而Zorbax SB-C18、Boston Green ODS等色谱柱的分离行为差异较大。为达到重复性要求，本试验色谱柱耐用性采用Wondasil C18-WR、Shim-pack VP-ODS、Inertsil ODS-SP色谱柱，试验结果一致。

4.4.2 仪器耐用性考察 分别采用岛津LC-20AT、Waters 2695及Agilent 1260型高效液相色谱仪，按2.1项色谱条件对同一供试品溶液（S1）进行测定，计算记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间。结果不同仪器下各特征峰相对保留时间RSD均小于3 %。证明试验方法在不同仪器上的耐用性好。

4.5 不同枳实品种研究

对全部18批样品进行检测的结果表明，特征图谱部分存在差异。经过进一步分析论证，系生产厂家采用的枳实品种不同引起。《中国药典》2015年版规定，枳实Aurantii Fructus Immaturus为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果[1]。但已有文献报道，二者所含成分差异较大[18-21]。本研究的香砂养胃丸的特征图谱也能反映出制剂中枳实原料药的差异。以酸橙入药的香砂养胃丸色谱图中，峰2（橙皮苷）前后各有一个柚皮苷和新橙皮苷峰，以甜橙入药的样品无此二峰，该分析结果与对应阳性试验结果及查阅的文献一致。