选择性PDGFR抑制剂CP-673451对A549细胞侵袭和迁移的抑制作用

平贯芳，郗玉玲，邓智建

肺癌是最常见的恶性肿瘤，也是全世界癌症死亡的首要病因[1-2]。近年来由于空气严重污染，中国肺癌的发病率逐年增加。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常见的类型，约占肺癌总数的85%[3-4]。目前虽然对肺癌的治疗已经进行了广泛的研究，但其治疗生存率仍然很低[5-6]。血小板衍生生长因子受体( platelet-derived growth factor receptors，PDGFR)是酪氨酸蛋白激酶家族的重要成员，具有细胞趋化、增殖、迁移、侵袭和信号传导的作用。研究发现，在转移与非转移性癌患者中PDGFR的过度表达，阻断PDGFR功能，可降低癌细胞的转移能力[7]。目前，由于PDGFR在肿瘤细胞存活和信号传导方面有重要作用，已成为研发抗肿瘤药物的新靶点[8]。CP-673451是一种选择性PDGFR抑制剂，其抗肿瘤的能力及机制尚不明确，本文旨在讨论CP-673451对非小细胞肺癌细胞的侵袭和迁移等恶性生物学行为的影响，为非小细胞肺癌的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料人肺癌细胞株A549细胞购于中国科学院上海细胞库；Matrigel基质胶、Transwell小室购于BD公司；选择性PDGFR抑制剂CP-673451(用二甲基亚砜配成10 μmol·L-1母液，临用前用RPMI1640稀释成工作浓度)购自美国Selleck Chemicals公司；RPMI1640及胎牛血清购自美国Gibco公司；细胞裂解液RIRP试剂盒购自美国Sigma公司；一抗p-Akt(Ser473)、p-p70S6K(Thr389)、p-S6(Ser235/236)、p-GSK-3β(Ser9)、p70S6K、GSK-3β、PDGFRβ(28E1)、p-PDGRα(Tyr849)/PDGFβ(Tyr857[C43E9])、p-Bad(Ser136[D25H8])、抗β-肌动蛋白，二抗辣根过氧化物酶购自美国Cell signal technology公司。

1.2 细胞培养细胞株A549细胞用含10%胎牛血清的RPMI培养基在5%CO2、37 ℃培养箱内培养。

1.3 观察指标

1.3.1 迁移实验Transwell法：取对数生长期A549细胞，消化后调整密度为1×105个·mL-1细胞接种于Boyden chamber(Costar®; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)上室，随机分为对照组和CP-673451组，分别加入1%胎牛血清(FBS)，下室加入650 μL含有10%FBS培养基作为趋化因子，CP-673451组上室细胞加入25、100或400 nMCP-673451孵育12 h，对照组常规培养，固定细胞，加入0.1%结晶紫染色，清除未迁移细胞，对迁移细胞进行拍照。加入10%醋酸进行细胞裂解，于595 nm比色法测定吸光度。划痕法：取对数生长期A549细胞，消化后调整细胞密度为1×105个·mL-1接种于96孔细胞培养板，随机分为对照组和CP-673451组。待细胞铺满后，用10 μL无菌枪头划痕，用PBS洗细胞3次，CP-673451组分别加入浓度为25、100、400 nMCP-673451，在37 ℃和5%CO2培养箱孵育12 h，对照组常规培养，划痕拍照。

1.3.2 侵袭实验采用Transwell侵袭实验考察细胞侵袭能力。24-transwell Boyden chamber上室均匀涂1 mg·ml-1的MatrigelTM基质胶，37 ℃下放置4 h。取对数生长期A549细胞，消化后调整密度为1×105个·mL-1细胞悬液加入24-transwell Boyden chamber上室，随机分为对照组和CP-673451组，下室加入650 μL培养基10%FBS作为趋化因子，CP-673451组上室分别加入浓度为25、100、400 nMCP-673451，在37 ℃和5%CO2培养箱孵12 h，对照组常规培养，固定细胞，0.1%结晶紫染色，清除未迁移的细胞，迁移的细胞进行拍照，加入10%醋酸进行细胞裂解，于595 nm比色法测定吸光度。

1.3.3 免疫荧光实验取对数生长期A549细胞，消化后调整密度为1×105个·mL-1细胞悬液接种于盖玻片上，随机分为对照组和CP-673451组，CP-673451组加入浓度为25、100、400 nMCP-673451在37 ℃和5%CO2培养箱孵育12 h，对照组常规培养，用4%多聚甲醛PBS在室温固定30 min，用PBS在室温漂洗3次，每次10 min，用0.1% Triton X-100的PBS在室温通透化处理20 min，用PBS在室温漂洗3次，每次10 min，并与5%正常血清封闭30 min。经四甲基异硫氰酸罗丹明培养30 min，采用荧光显微镜对肌动蛋白纤维进行拍照。

1.3.4 Western印迹实验用细胞裂解液RIRP裂解经CP-673451处理A549细胞，提取的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗孵育过夜、洗涤，加入二抗孵育2 h，化学显影及定影。

2 结果

2.1 CP-673451对A549细胞迁移、侵袭的影响迁移实验结果显示25、100、400 nMCP-673451均可抑制A549细胞迁移能力。Transwell法对A549细胞的抑制率分别为56.34%、68.72%和84.56%，且成浓度依赖性，结果见图1(A、B)，划痕法对A549细胞的抑制率分别为34.62%、65.27%和81.56%，均呈浓度依赖性，结果见图1(C、D)。侵袭实验结果显示25、100、400 nMCP-673451均能有效抑制A549细胞的侵袭能力，抑制率分别为42.23%、67.89%和89.72%，呈剂量依赖性，结果见图1(E、F)。由于在细胞运动中片状伪足形成起重要作用，免疫荧光实验结果显示CP-673451显著抑制A549细胞伪足形成，提示CP-673451能抑制肿瘤细胞的能动性，抑制率分别为57.21%、78.92%和89.22%，呈浓度依赖性，结果见图1(G、H)。

A、B：CP-673451对A549细胞迁移实验及抑制率的影响；C、D：CP-673451对A549细胞划痕实验及抑制率的影响；E、F：CP-673451对A549细胞侵袭实验及抑制率的影响；G、H：CP-673451对A549细胞对肌动蛋白纤维形成和抑制率的影响。图1 CP-673451对A549细胞板状伪足形成、细胞迁移和侵袭的影响

2.2 CPCP-673451抑制PDGFR介导的信号传导Western印迹实验结果显示浓度为1、2、4 μMCP-673451均能有效抑制A549细胞的PDGFR的下游信号传导，抑制Akt、GSK-3β、p70S6和S6蛋白的磷酸化，且呈浓度依赖性，且治疗后的总蛋白水平比较无显著变化。见图2。

图2 CP-673451抑制非小细胞肺癌细胞中CP-673451路PDGFR介导的信号通路

3 讨论

研究发现PDGFR在肿瘤细胞的迁移和增殖中发挥着重要的作用，PDGFR激活和过量表达有助于肿瘤发生和转移[9-10]。因此，抑制PDGFR介导的信号传导通路是治疗癌症的一个新的方向。PDGFR在细胞的增殖和转换中起重要作用，PDGFR抑制剂可影响肿瘤细胞的生长、转移和浸润。CP-673451是一种选择性PDGFRα/β抑制剂，比作用于其他血管生成受体选择性高450倍以上，有别于多靶点酪氨酸激酶抑制剂，减少了多靶点制剂的不良反应[11]。目前CP-673451能有效抑制裸鼠肺癌、结肠癌移植肿瘤的生长，但体外研究对肺癌细胞尤其是非小细胞肺癌的影响较少。本研究观察了CP-673451对体外非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。研究结果显示，CP-673451能有效抑制肺癌细胞的活力，诱导细胞凋亡，并抑制细胞伪足形成、迁移和侵袭，推测PDGFR对非小细胞肺癌信号传导有抑制作用。

PDGFRα和PDGFRβ是受体酪氨酸激酶，二聚化的PDGF配体与受体结合，能够诱导PDGFR二聚化和胞妹酪氨酸残基磷酸化，介导下游信号传导，PI3K/AKT信号通路是一条PDGF激活的重要信号通路，参与调控细胞的增殖、迁移、分化等功能[12-14]，PI3K/AKT信号通路的失调在非小细胞肺癌中发生比例较高，影响了癌细胞的迁移和侵袭[15]。本研究结果显示CP-673451抑制了A549细胞Akt、GSK-3β、p70S6和S6蛋白的磷酸化，且呈浓度依赖性。CP-673451对非小细胞肺癌的抗癌活性可能与抑制PI3K/AKT信号传导通路有关，提示CP-673451在外的抗肿瘤作用是通过抑制Akt信号通路产生的。本研究结果进一步完善了CP-673451抗瘤谱及抗肿瘤分子机制，为其进一步研发提供了理论基础和实验依据。