叶酸与TSLC1在喉鳞状细胞癌中的相关性研究

常 浩，李阳阳，马 民，韩亚静

喉鳞状细胞癌(carcinoma of larynx)是耳鼻喉科中最为常见的喉部上皮组织恶性肿瘤之一，以鳞状细胞癌为最多见，约占90%[1-2]。喉鳞状细胞癌的发生、发展受环境、生活习惯、内分泌因素、遗传因素和肿瘤基因改变等多种因素的作用和影响。最近研究表明，叶酸缺乏可能与人类肿瘤的发生有关[3]。TSLC1(tumor suppressor in lung cancer,肺癌肿瘤抑制因子-1)与多种恶性肿瘤的发生、发展、浸润和转移密切相关[4]。但二者之间的相关性，国内外鲜有报道。本研究采用了免疫组化、放射免疫学的方法，探讨喉鳞状细胞癌患者血清中叶酸的含量和癌组织细胞中TSLC1蛋白表达与喉鳞癌病变程度之间的关系。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料观察组：选取2011年9月至2014年9月河南科技大学第一附属医院耳鼻喉科手术切除的喉鳞状细胞癌组织60例及同一病人的癌旁组织(距离肿瘤组织边缘0.5 cm非肿瘤组织)石蜡标本为对照。所有被抽取的患者术前均未经过任何辅助性放、化疗，且均为第一次入院病例。所有病例病理诊断明确，临床资料真实可靠，病理分期按照国际TNM分期标准。对照组：30例健康对照者通过门诊常规体检的方式募集，排除营养性巨幼红细胞性贫血及其他类型的贫血、上消化道疾病及有手术史、半年内B族维生素使用史等。本研究通过本院医学伦理委员会批准。

1.2 实验方法抽取纳入试验的患者静脉血，4 ℃离心(3 000 r·min-1，15 min)，分离血清，使用放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)定量检测上述90例患者的血清叶酸水平(试剂盒及所用辅助用品均与仪器配套)，严格按照试剂盒操作说明书进行并详细记录。血清叶酸诊断采用国际通用的<6.8 mmol·L-1(3 ng·mL-1)标准。组织中TSLC1蛋白检测：取喉鳞状细胞癌患者的癌组织和癌旁组织石蜡，每一石蜡块连续切片3张，厚度4 μm，1张常规HE染色，再次病理证实，另2张常规脱蜡水化，采用枸橼酸缓冲液煮沸法进行抗原修复后按SP试剂盒(北京康为世纪公司)说明书进行操作。结果判读：与阴性对照片相比，TSLC1蛋白以细胞质或细胞膜内发现棕黄色颗粒判断为阳性细胞。采用双盲法，高倍镜下随机选取10个视野，每个视野计数200个细胞，按照文献[5]方法统计阳性细胞数：<30%为阴性(-)，≥30%为阳性(+)。

1.3 统计方法使用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计学处理，采用卡方检验、Fisher’s精确概率法、单因素方差分析、SNK-q检验、Spearman相关分析、logistic回归等统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 喉鳞状细胞癌组与对照组叶酸含量喉鳞状细胞癌组血清中叶酸的含量(3.35±1.51) ng·mL-1明显低于对照组(4.40±1.47) ng·mL-1(t=3.13,P<0.05)。

2.2 TSLCI在喉鳞状细胞癌及癌旁组织的表达TSLC1蛋白在癌旁组织中的表达率为78%，TSLC1蛋白在癌组织中的表达率为20%，差异有统计学意义(χ2=28.229,P<0.01)。见图1。

红箭头：癌旁组织；蓝箭头：癌组织。图1 TSLC1蛋白在癌旁组织和癌组织中的表达(SP，×100)

2.3 叶酸含量与喉鳞状细胞癌临床特征用单因素方差分析比较血清中叶酸浓度在喉鳞状细胞癌各个不同临床特征之间的水平：叶酸的表达水平与喉鳞状细胞癌临床分期、淋巴结转移、组织分化程度有关(P<0.05)，与年龄无关(P>0.05)，见表1。

表1 喉鳞状细胞癌患者血清叶酸含量之间的关系

2.4 TSLCI表达与喉鳞状细胞癌临床特征TSLCI蛋白的表达与临床分期、淋巴结转移、组织分化程度有关(P<0.05)，与年龄无关(P>0.05)，见表2。

表2 喉鳞状细胞癌组织中TSLC1蛋白表达之间的关系

2.5 癌症组叶酸含量与癌组织中TSLC1表达的关系Spearman相关分析显示：r为0.642，P<0.01，两指标呈正相关。logistic回归模型分析显示，OR值为3.91，P<0.01，表明喉鳞状细胞癌患者血清中的叶酸含量每增加0.003 μmol·L-1，TSLC1的蛋白表达阳性率增加3.91倍。

3 讨论

喉癌是耳鼻喉科最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。现已发现多个癌基因和抑癌基因的变异与其发生发展和转归有关[6]。多基因表达异常是其发生发展的基础。

叶酸是一种水溶性维生素，其主要的生物学功能是作为一碳单位的载体参与细胞内的甲基化反应、DNA的成分和修复、细胞的凋亡等[7-8]。McGlynn等[9]观察到的结肠腺瘤性息肉患者体内叶酸的浓度要明显低于没有息肉的正常对照组，叶酸浓度在正常结肠组织、结肠息肉的边缘组织、息肉组织中呈梯度性降低。Sie等[10]表明，实验孕鼠使用足够叶酸的食物后，可显著改变子代错误DNA的编码水平，而减少结肠癌的发生。本研究结果发现，血清中的叶酸在健康对照组中的浓度明显要高于喉鳞状细胞癌组，并且喉鳞状细胞癌组中随着病变程度的加重，血清中的叶酸逐渐降低。

TSLC1是一种抑癌基因，参与细胞间的黏附、细胞间的运动、信号传导及免疫调节，并在抑制肿瘤的发生、发展中起重要作用。TSLC1可广泛表达于除骨骼肌外的大多数正常组织，但在许多肿瘤中，特别是侵袭性强的肿瘤中呈现低表达或不表达[11-12]。Lung等[13]运用PCR和免疫组化技术阐明了TSLC1蛋白的缺失可以作为一个在鼻咽癌患者中判断有无淋巴结转移的指标，在淋巴结转移的鼻咽癌患者组织中，大部分的TSLC1蛋白表达缺失。Steenbergen等[14]研究发现，实验中的宫颈癌细胞株82%的TSLC1基因表达的蛋白下降。在正常宫颈组织和Ⅰ度CIN组织中未检测到TSLC1蛋白表达下降，TSLC1基因表达下降在Ⅱ度和Ⅲ度CIN组织中的检出率分别为58%和35%，并且TSLC1表达下降的频率随着宫颈病变的严重程度、病理分级程度的增高而增加。本研究与文献报道相似。

本研究发现随着喉鳞状细胞临床分期加重、组织分化程度降低、淋巴结转移，患者血清中叶酸含量逐渐降低，组织中TSLC1蛋白表达逐渐降低，而且叶酸浓度与TSLC1蛋白表达呈正相关，喉鳞状细胞癌患者血清中叶酸含量减少0.003 μmol·L-1，TSLC1蛋白表达阳性率降低3.91倍，这可能是因为叶酸可以修复受损的DNA和引导正确的DNA复制，从而促使TSLC1蛋白正常表达。

叶酸缺乏可能导致基因组DNA低甲基化、组蛋白甲基化改变和致癌基因激活，致使一系列的DNA损伤、DNA链断裂和染色体的破坏，参与喉鳞状细胞癌的发生、发展过程。增加膳食中叶酸的摄入会降低患病风险，可望成为喉鳞状细胞癌简便易行的预防措施，同时TSLC1可能成为其基因治疗的靶点，为其早期预防和临床靶向治疗提供科学依据。