miR-105靶向负调控KIFC1抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力*

赵继聪， 王 薇， 刘建伟， 马建欣， 徐德利， 郭靖涛

(1承德市中心医院心胸外科, 2承德市第三医院放疗中心, 3承德市双滦区医院精神科, 4承德市中心医院心内科， 河北 承德 067000)

肺癌为常见的肺部恶性肿瘤，其发病率和死亡率居所有肿瘤之首[1]。非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)是最常见的肺癌之一，约占肺癌的80 %左右，5年生存率很低[2]，该病确诊时大多已为中晚期，临床上多用手术联合化疗的治疗方案，但其预后仍不佳。因此，寻找高效的治疗药物及方法意义重大。驱动蛋白在细胞中具有重要作用，如胞内运输和细胞分裂等，其在多种人类肿瘤中均具有重要作用。驱动蛋白家族有40个成员，均含有1个驱动蛋白域和1个叉头关联域[3]。驱动蛋白家族成员C1(kinesin family member C1，KIFC1)为驱动蛋白14家族中的唯一成员，其存在于哺乳动物细胞内，具有4个转录本，20个外显子，与其它驱动蛋白家族成员一样参与细胞内物质转运[4]。大量研究表明KIFC1参与肿瘤的发生发展。Xiao等[5]报道，KIFC1通过延迟细胞周期和保护癌细胞存活等途径促进恶性肿瘤生长和转移，可能为一个潜在的化疗靶点。大量研究报道，KIFC1在乳腺癌、胃癌和前列腺癌中均高表达，在肿瘤的发生发展中具有重要作用[6-8]。但KIFC1在非小细胞肺癌中的作用机制尚未明确。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)在肿瘤发生发展中的作用已有广泛研究，其在肺癌发病机制中的作用也有报道[9]。miR-105在肝癌和胶质瘤中高表达[10-11]，在前列腺癌中低表达[12]。有研究报道miR-105在非小细胞肺癌中低表达，但其具体的作用机制尚未完全清楚。本研究将检测非小细胞肺癌组织、非小细胞肺癌细胞中miR-105和KIFC1的表达，观察过表达miR-105、敲减或过表达KIFC1对非小细胞肺癌细胞活力、迁移和侵袭能力的影响。

材 料 和 方 法

1 材料

人正常胚肺成纤维细胞MRC-5和人NSCLC H460细胞购自ATCC；组织标本为承德市中心医院2018年3月～2018年9月手术切除的非小细胞肺癌组织及癌旁组织(45例)。本研究经本医院医学伦理委员会批准，所有患者及家属均签署知情同意书。BCA蛋白定量试剂盒、脂质体LipofectamineTM2000、逆转录试剂盒和双萤光素酶报告基因检测试剂盒购于TaKaRa；Transwell小室、基质胶、RPMI-1640培养基和胎牛血清均购自Sigma。凝胶成像分析仪购于柯达公司；半干转膜仪购于BIO-RAD。

2 方法

2.1细胞培养 正常胚肺成纤维细胞MRC-5、非小细胞肺癌细胞H460均用含有10 %胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中常规培养。

2.2细胞转染 收集对数生长期的H460细胞将细胞分为miR-105组(转染miR-105 mimics)、miR-NC组[转染mimics阴性对照(negative control,NC)序列]、inhibitor-NC组(转染inhibitor-NC序列)、inhibitor-miR-105组(转染miR-105 inhibitor)、si-KIFC1组(转染KIFC1siRNA)、si-NC组(转染阴性对照siRNA)、miR-105+vector组(miR-105 mimics和pcDNA 3.1共转染)和miR-105+KIFC1组(miR-105 mimics和pcDNA 3.1-KIFC1共转染)，转染成功后用于后续实验。

2.3RT-qPCR实验 取适量对数生长期的各组细胞，用TRIzol裂解细胞后，按RNA抽提试剂盒说明书操作提取RNA，进行定量，再用逆转录试剂盒按说明书操作合成cDNA。最后按照RT-qPCR试剂盒说明书操作进行miR-105和KIFC1 mRNA的检测。用2-ΔΔCt计算miR-105和KIFC1 mRNA的相对表达水平。miR-105的上游引物序列为5’-GCCCTCGAGATACCATATCTATCCCCTTTTTCA-3’，下游引物序列为5’-GCCGAATTCCAACCATGAAGATACGAATTGATG-3’; KIFC1 的上游引物序列为5’-TGAGCAACAAGGAGTCCCAC-3’，下游引物序列为5’-TCACTTCCTGTTGGCCTGAG-3’；GAPDH 的上游引物序列为5’-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3’, 下游引物序列为5’-AGATCCACAACGGATACATT-3’; U6的上游引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’ 。

2.4Western blot实验 取适量对数生长期的各组细胞，用RIPA裂解后提取总蛋白，并用BCA法进行蛋白定量后变性，蛋白一样进行SDS-PAGE分离，之后转至PVDF膜，封闭2 h，加入Ⅰ抗4 ℃孵育过夜。次日，洗膜后再用辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗37 ℃孵育2 h。结束后加入ECL发光液，显影曝光。以目的条带灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表达。

2.5MTT实验 取适量对数生长期的各组细胞，加入20 μL MTT(0.5 g/L)溶液，继续培养4 h，弃去上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡，使结晶充分溶解，在490 nm波长下检测细胞吸光度(A490)值，细胞活力与细胞A490呈正相关。

2.6集落形成实验 将细胞生长至75%融合度时，用胰酶消化细胞，制备成单细胞悬液。取直径60 mm的平皿，每个平皿接种1 000个细胞，放置在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，2～3 d更换1次培养液，培养10～14 d。当平皿底部能用肉眼观察到小白点时用甲醇固定15 min，然后用吉姆萨染色25 min，最后进行集落计数。

2.7Transwell检测细胞的迁移和侵袭能力 取适量对数生长期的各组细胞，调整细胞密度。取104个细胞加入上室内，再取600 μL含血清的培养基加入下室，常规培养过夜。次日，取出小室，用棉签擦去上室内的细胞，PBS洗涤3次，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗涤3次。显微镜下观察小室下表面附着的迁移细胞，随机取3个视野拍照计数，取平均数。

细胞侵袭实验检测操作步骤按照细胞迁移检测实验调整细胞密度，在小室上表面涂抹适量厚度基质胶，然后再加入104个细胞，后续操作步骤同上。最后显微镜下观察小室下表面附着的侵袭细胞数，随机选取3个视野拍照计数，取平均数。

2.8双萤光素酶报告基因实验 取适量对数生长期细胞，用TRIzol裂解液裂解，取5 μL裂解液与萤火虫萤光素酶缓冲液和5 μL底物，混匀用液闪测定仪检测发光强度。然后加入海肾萤光素酶缓冲液和5 μL腔肠素底物，混匀，测得海肾萤光素酶活性。psiCHECK2载体以萤火虫萤光素酶活性为内参照，以psiCHECK2-KIFC1-3’UTR WT和psiCHECK2-KIFC1-3’UTR MUT的表达为对照，观察miR-105对KIFC1表达的影响。

3 统计学处理

所有的数据均采用SPSS 21.0软件进行分析。计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，符合正态分布的计量资料，两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析；不符合正态分布的计量资料，两组比较采用Mann-WhitneyU检验，多组比较采用K检验，进一步通过Nemenyi法进行多重比较。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 非小细胞肺癌组织中miR-105低表达、KIFC1高表达

将非小细胞肺癌组织和癌旁组织分别标记为cancer组和adjacent组。与adjacent组相比，cancer组的miR-105表达显著降低，KIFC1 的蛋白表达显著升高(P<0.05); miR-105与KIFC1蛋白的表达水平在非小细胞肺癌组织中呈负相关，见图1。

Figure 1. The expression of miR-105 and KIFC1 in the tissues of patients with non-small-cell lung cancer. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsadjacent.

图1 miR-105和KIFC1在非小细胞肺癌患者组织中的表达

2 非小细胞肺癌细胞中miR-105和KIFC1的表达

与MRC-5细胞相比，人非小细胞肺癌 H460细胞中KIFC1的mRNA表达显著升高，miR-105的表达显著降低，KIFC1 的蛋白表达显著升高(P<0.05)，见图2。

Figure 2. The expression of miR-105 and KIFC1 in non-small-cell lung cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMRC-5.

图2 人非小细胞肺癌细胞中miR-105和KIFC1表达水平的比较

3 过表达miR-105抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力

将miR-NC和miR-105-mimics转染H460细胞，标记为miR-NC组和miR-105组，与miR-NC组相比，miR-105组细胞中miR-105表达显著升高(P<0.05)，见图3A；在72、96和120 h时细胞增殖能力显著降低(P<0.05)，见图3B、C，此外，细胞的迁移和侵袭数量亦显著降低(P<0.05),见图3D、E。可见，过表达miR-105抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

Figure 3. Over-expression of miR-105 inhibited the viability, migration and invasion abilities of non-small cell lung cancer cells. A: the expression level of miR-105 in the H460 cells transfected with miR-105 mimics; B and C: over-expression of miR-105 on the proliferation of H460 cells; D and E: over-expression of miR-105 on the migration and invasion abilities of H460 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

图3 过表达miR-105抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力

4 敲减KIFC1表达抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力

将si-NC和si-KIFC1转染至H460细胞，分别标记为si-NC组和si-KIFC1组。与si-NC组相比，si-KIFC1组细胞中KIFC1的蛋白表达显著降低(P<0.05)，见图4A；72、96和120 h时细胞的增殖能力显著降低(P<0.05)，见图4B、C；此外，细胞迁移数量及侵袭数量亦显著降低(P<0.05)，见图4D、E。可见，敲减KIFC1的表达可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

5 KIFC1是miR-105的靶基因

通过TargetScan对miR-105和KIFC1结合进行预测，miR-105和KIFC1之间存在结合位点,见图5A。构建含有miR-105结合位点的KIFC1-3’UTR野生型及突变型[以下称为KIFC1野生型(WT)及突变型(MUT)]报告基因载体，在H460细胞中转染miR-105 mimics和KIFC1野生型及突变型报告基因载体。用双萤光素酶报告基因载体实验检测H460细胞的萤光素酶相对活性，与miR-NC组相比，miR-105组WT载体的细胞萤光素酶相对活性显著降低，而MUT载体的细胞萤光素酶相对活性未发生显著变化，见图5B；与miR-NC组相比，miR-105组细胞KIFC1的mRNA表达显著降低，KIFC1的蛋白表达显著降低；与inhibitor-NC组相比，inhibitor-miR-105组细胞KIFC1的mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.05)，见图5C、D。可见，KIFC1是miR-105的靶基因。

Figure 4. Knockdown of KIFC1 expression inhibited the proliferation, migration and invasion abilities of non-small cell lung cancer cells. A: knockdown of KIFC1 expression on the protein expression of KIFC1 in H460 cells; B and C: knockdown of KIFC1 expression on the proliferation of H460 cells; D and E: knockdown of KIFC1 expression on the migration and invasion abilities of H460 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-NC group.

图4 敲减KIFC1表达抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力

6 过表达KIFC1逆转了miR-105对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用

与miR-NC组相比，miR-105组的KIFC1蛋白表达显著降低(P<0.05)，在72、96和120 h时细胞的增殖能力均显著下降(P<0.05)，细胞迁移和侵袭能力亦显著降低(P<0.05)；与miR-105 +vector组相比，miR-105+KIFC1组KIFC1的表达显著升高(P<0.05)，在72、96和120 h时细胞的增殖均显著升高(P<0.05)，细胞的迁移和侵袭能力亦显著升高(P<0.05)，见图6。可见，过表达KIFC1逆转了miR-105对非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。

讨 论

越来越多的microRNA被证明在限制肿瘤生长和非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程中发挥重要作用[13]。Lu等[14]在非小细胞肺癌的研究中运用RT-qPCR法检测正常肺组织和非小细胞肺癌组织中miR-105-1的表达发现，miR-105-1在NSCLC中低表达，且其与患者的总生存率和无病生存率低下有关。Jin等[15]在非小细胞肺癌的研究中发现过表达miR-105可增加A549和Calu-3等细胞的活力和迁移能力，不影响细胞凋亡。本研究运用RT-qPCR检测了非小细胞肺癌组织和非小细胞肺癌细胞中miR-105的表达，观察到miR-105在非小细胞肺癌中低表达，这与Lu等[14]的研究结果相吻合，但与Jin等[15]人的研究结果相悖。

KIFC1是一种C型末端驱动蛋白，在肿瘤细胞中心体聚集过程中起着不可缺少的作用[16]。已有研究发现KIFC1在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌和前列腺癌等癌中都存在广泛表达,且与肿瘤发展和预后紧密相关。Han等[17]在肝细胞癌的研究中发现，KIFC1高表达，其在体外和体内均诱导上皮-间充质转化和肝细胞癌转移。Liu等[18]运用RT-qPCR和Western blot检测NSCLC组织和癌旁正常肺组织样本中KIFC1表达发现，KIFC1在NSCLC组织中高表达，且沉默KIFC1可抑制NSCLC细胞增殖，进一步用流式细胞术检测细胞周期发现，沉默KIFC1可使细胞周期阻滞在G2/M期，提示KIFC1可作为肺癌诊断治疗的生物标志。本研究运用RT-qPCR和Western blot检测了非小细胞肺癌组织、非小细胞肺癌细胞中KIFC1 的mRNA和蛋白的表达发现，KIFC1在非小细胞肺癌中高表达，这与前期的研究结果相一致。

Figure 5. KIFC1 is the target of miR-105 determined by bioinformatic method and double luciferase reporter assay. A: the complementary sequence; B: the effect of miR-105 on the relative luciferase activity in H460 cells; C: the effect of miR-105 on the mRNA expression of KIFC1 in H460 cells; D: the effect of miR-105 on the protein expression of KIFC1 in H460 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group;#P<0.05vsinhibitor-NC group.

图5KIFC1是miR-105的靶基因

Figure 6. Over-expression of KIFC1 reversed the inhibitory effect of miR-105 on the proliferation, migration and invasion abilities of non-small cell lung cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group;#P<0.05vsmiR-105+vector group.

图6 过表达KIFC1逆转了miR-105对非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用

肿瘤的生长、转移是癌症患者死亡的主要原因，其通过各种旁分泌和内分泌机制在细胞之间交换细胞物质是细胞间信号传递的重要手段[19]。肿瘤的生长转移为其高致死率的重要原因。Zhou等[20]研究证实，miR-105为转移性乳腺癌细胞特有的表达和分泌，其可促进早期乳腺癌细胞的侵袭，并增加远处血管通透性，而在高度转移的肿瘤中miR-105可抑制癌细胞的转移，其机制与靶向紧密连接蛋白ZO-1有关。本研究发现,过表达miR-105或敲减KIFC1的表达均可抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力，过表达KIFC1可逆转过表达miR-105对H460细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。

综上所述，miR-105可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其机制与靶向负调控KIFC1有关。