Apelin-13通过PI3K/Akt信号通路抑制尼古丁诱导的H9c2细胞凋亡*

张海增， 全 慧， 单晓琼， 田秋云， 张福坤， 范小芳， 龚永生

(温州医科大学低氧医学研究所， 浙江 温州 325035)

尼古丁(nicotine)是烟草制品的关键成分，也是香烟烟雾中的主要的有害物质[1]。研究显示尼古丁通过诱导心肌细胞凋亡导致心血管疾病[2-5]。Apelin-13是apelin受体(apelin receptor, APJ受体)拮抗剂，并且在心脏中高度表达[6]。Apelin/APJ系统作为心血管内稳态的关键介质发挥作用，并参与心血管疾病的病理生理学，以apelin/APJ轴为靶点可预防心血管疾病[7]。最近的证据表明，apelin/APJ系统通过不同的信号途径，包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,Erk1/2)和caspase信号通路和自噬途径，影响心肌的细胞凋亡[8]。然而 apelin-13对尼古丁诱导的心肌细胞凋亡的影响以及相应的作用机制尚未见相关报道。我们的研究表明，apelin-13及其类似物可能是开发治疗香烟烟雾相关心血管疾病和损伤的有效药物。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1细胞系 大鼠H9c2心肌细胞购自中科院上海细胞库。

1.2试剂及抗体 尼古丁和apelin-13购自Sigma；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、DMEM细胞培养基和0.25%胰酶购自Gibco；PI3K/Akt抑制剂LY294002及抗PI3K、p-PI3K、p-Akt、Akt、cleaved caspase-3、caspase-3、GAPDH、APJ、Bax和Bcl-2抗体均购自Cell Signaling Technology；Annexin V-FITC/PI检测试剂盒购自BD。

2 主要方法

2.1细胞培养 采用DMEM培养液(含10%胎牛血清和1%青-链霉素)，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中常规培养。

2.2细胞分组 不同浓度apelin-13对尼古丁诱导的细胞凋亡的影响时，分为对照(control)组、尼古丁(nicotine)组、apelin-13(100 μmol/L)组、apelin-13(200 μmol/L)组、尼古丁+apelin-13(100 μmol/L)组和尼古丁+apelin-13(200 μmol/L)组。检测apelin-13通过PI3K/Akt信号通路对尼古丁诱导的细胞凋亡的影响，分为对照组、尼古丁组、LY294002组、apelin-13+尼古丁组和apelin-13+尼古丁+LY294002组。

2.3细胞给药处理 取对数生长期的H9c2细胞，待细胞长到60%左右时给予药物处理。LY294002(20 μmol/L)和apelin-13(100 μmol/L)采用预孵育1 h处理，之后尼古丁(10 μmol/L)刺激细胞48 h处理[9]。

2.4Western blot测定相关蛋白含量 取对数生长期的H9c2细胞，待细胞长到60%左右时给予药物处理。48 h后收集并裂解细胞，提取总蛋白，用BCA法检测蛋白含量。取待测蛋白质30 μg加上样缓冲液煮沸变性，行10%～12% SDS-PAGE，100 V电泳1.5 h，转膜2 h，加入抗Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K、Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3和GAPDH(1∶1 000)抗体，4 ℃过夜，常规洗涤，加相应Ⅱ抗(1∶5 000)，37 ℃孵育60 min，洗涤，电化学法发光，显影，扫描，用凝胶图像处理系统分析目标条带与内参照条带吸光度的比值，实验重复3次。采用ImageJ进行灰度值分析，并在Prism上进行统计学分析。

2.5流式细胞仪检测凋亡 取对数生长期的H9c2细胞，待细胞长到60%左右时给予药物处理。48 h后收集细胞并计数，使密度为5×108/L，然后用预冷的PBS冲洗2次，吸去上清液，用100 μL结合缓冲液重新悬浮细胞,转移至1.5 mL EP管中。随后，将5 μL膜联蛋白V-FITC和5 μL碘化丙啶PI添加到每个EP管中。在室温下避光孵育15 min，采用流式细胞术检测细胞凋亡。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析，数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。多组间差异采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Apelin-13抑制尼古丁诱导的H9c2细胞凋亡

100 μmol/L和200 μmol/L的apelin-13对尼古丁诱导的细胞凋亡均有明显的保护作用，且两组之间的保护作用没有明显差异。和正常对照组相比，尼古丁组细胞凋亡率明显增加(P<0.01)，凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表达显著上调，Bcl-2和APJ的表达明显下调(P<0.01)；与尼古丁组相比，apelin-13+尼古丁组细胞的凋亡率明显降低(P<0.01)，凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表达显著下调，Bcl-2和APJ的表达显著上调(P<0.01)，见图1。

2 Apelin-13的抗凋亡作用可能和PI3K/Akt信号通路有关

与正常对照组相比，尼古丁组p-Akt和p-PI3K蛋白表达明显下调(P<0.01)，Akt和PI3K蛋白的表达没有明显变化；和尼古丁组相比，apelin-13+尼古丁组p-Akt和p-PI3K蛋白表达明显上调(P<0.05)，Akt和PI3K蛋白的表达没有明显变化，见图2。

Figure 1. Effect of apelin-13 on nicotine-induced apoptosis of H9c2 cells. A: the protein expression levels of APJ, Bax, Bcl-2, caspase-3 and cleaved caspase-3 in H9c2 cells; B: the apoptosis was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsnicotine group.

图1 Apelin-13对尼古丁诱导的H9c2细胞凋亡的影响

Figure 2. Effect of apelin-13 on nicotine-induced PI3K/Akt signaling pathway in H9c2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsnicotine group.

图2 Apelin-13对尼古丁诱导的H9c2细胞信号PI3K/Akt信号通路的影响

3 阻断PI3K/Akt信号通路可减弱apelin-13的抗凋亡作用

与正常对照组相比，PI3K/Akt信号抑制剂LY294002组细胞凋亡率明显增加(P<0.01)，凋亡相关蛋白Bax和cleaved caspsae-3的表达量显著上调，而Bcl-2、p-Akt和p-PI3K蛋白表达明显下调(P<0.05)，Akt和PI3K蛋白的表达没有明显变化；与apelin-13+尼古丁组相比，apelin-13+尼古丁+LY294002组细胞凋亡率明显增加(P<0.01)，凋亡相关蛋白Bax和cleaved caspsae-3的表达显著上调，而Bcl-2、p-Akt和p-PI3K蛋白表达明显下调(P<0.05)，Akt和PI3K蛋白的表达没有明显变化，见图3、4。

讨 论

心血管危险因素在心血管疾病的发展、进展和预后中起着重要作用，包括高血压、高脂血症、吸烟、酗酒、糖尿病、缺乏锻炼、肥胖和遗传因素等。全世界每年有1 600多万人死于心血管疾病，纠正这些危险因素是降低心血管负担的一个好策略。有充分文献证明，吸烟是许多心血管疾病的一个重要危险因素，心血管疾病是导致吸烟者过早死亡的主要原因之一[10]。最新报道表明，与从未吸烟的人相比，吸烟者至少会失去10年的预期寿命。然而，很少有预防或治疗措施对香烟烟雾相关的心血管毒性作用的报道。Apelin-13是内源性肽，作用于APJ受体，而APJ是G蛋白偶联受体家族的成员。Apelin-13和APJ在心脏中高度表达。最近的证据强烈表明，apelin/APJ系统通过不同的信号途径，包括PI3K/Akt、Erk1/2和caspase信号通路和自噬途径，影响心肌细胞凋亡[11]。当心肌细胞受到尼古丁或烟雾刺激时，会诱导氧化反应的发生，线粒体的代谢和功能特征改变并且线粒体介导的内在凋亡途径启动，从而引起线粒体功能障碍和凋亡蛋白的变化，包括Bax和Bcl-2之间的互作用、细胞色素C和caspase的最终活化，特别是caspase-3，这些凋亡相关蛋白在细胞损伤及凋亡的发生发展方面起着重要的作用[12-13]。

本实验采用大鼠H9c2细胞体外模拟吸烟引起心肌细胞凋亡模型。在实验中发现，尼古丁可以促进大鼠H9c2细胞的凋亡，当给予apelin-13不同浓度100 μmol/L和200 μmol/L进行预孵育1 h，再给予尼古丁(10 μmol/L)刺激48 h，结果显示，当给予apelin-13进行预孵育时可以抑制尼古丁诱导的H9c2细胞的凋亡，凋亡相关蛋白Bax和cleaved caspase-3的表达明显上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达也明显上调，不同浓度apelin-13(100 μmol/L和200 μmol/L)对尼古丁诱导的H9c2细胞凋亡没有明显差异，且apelin-13本身并不对H9c2细胞本身产生毒性作用，因此在接下来的实验中采用了100 μmol/L的浓度进行实验。报道显示，apelin-13预处理心肌细胞可有效抑制葡萄糖剥夺(GD)诱导的细胞凋亡，并可显着增加Akt和mTOR的磷酸化，同时上调Bcl-2蛋白和下调Bax和裂解的caspase-3[11]。Apelin/APJ系统也增加Bcl-2的表达，并降低Bax蛋白的表达[14]。在apelin-13刺激后，PI3K和Akt激活会增加。本实验的实验结果同样显示，当给予尼古丁刺激时，p-PI3K和p-Akt蛋白的表达显著下调，但当给予apelin-13预孵育后，结果显示p-PI3K和p-Akt蛋白的表达显著上调。

Figure 3. Role of blocking PI3K/Akt signaling pathway in the protective effect of apelin-13 on H9c2 cells. A: the protein expression levels of Bax, Bcl-2, caspase-3 and cleaved caspase-3 in H9c2 cells; B: the apoptosis was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsnicotine group;△P<0.05,△△P<0.01vsnicotine+apelin-13 group.

图3 阻断PI3K/Akt信号通路对apelin-13保护H9c2细胞效应的影响

Figure 4. Role of blocking PI3K/Akt signaling pathway in the effect of apelin-13 on the expression of PI3K/Akt signaling pathway-related proteins. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsnicotine group;△P<0.05,△△P<0.01vsnicotine+apelin-13 group.

图4 阻断PI3K/Akt信号通路时apelin-13对该通路相关蛋白表达的影响

在相关报道中发现，PI3K/Akt途径在细胞增殖和存活等细胞功能中起着至关重要的作用，同时PI3K/Akt是抗细胞凋亡重要的调节因子，它通过磷酸化或抑制其下游靶蛋白，如caspase-9、BAD、mTOR和NF-κB等，介导各种生长因子来调节细胞功能，从而来发挥其调控生长、凋亡和存活等作用[15-16]。为了进一步验证apelin-13的抗凋亡作用是否通过PI3K/Akt信号通路，本实验选用了PI3K特异性抑制剂LY294002用于接下来的实验，结果显示，给予LY294002预孵育1 h后，p-PI3K和p-Akt蛋白的表达明显降低，表明LY294002减弱了apelin-13的抗凋亡作用，导致细胞凋亡的增加。Akt是一种关键的BAD激酶，可激活BAD中Ser136位点的磷酸化[15]。当磷酸化的BAD与14-3-3蛋白结合时，它们阻止BAD与Bcl-2或Bcl-xL形成二聚体，因此有效地阻断由BAD诱导的细胞凋亡，并抑制促细胞凋亡活性。由另一种促凋亡蛋白Bax诱导Akt的磷酸化也显示其促凋亡功能[17]。用特异性PI3K抑制剂渥曼青霉素和LY294002处理后， BAD和Bax同样能够抑制Akt的磷酸化[18]。

本实验阐述了apelin-13对尼古丁及烟草刺激下导致的心血管疾病起保护作用的机理。Apelin-13通过PI3K/Akt信号通路抑制尼古丁诱导的H9c2细胞凋亡。