钌多吡啶配合物诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡*

黄蓝仪， 陈 瑶， 吴 鹏， 梁延华， 李 敏， 邢德刚

( 广东药科大学， 广东 广州 510006)

目前，恶性肿瘤的发病率呈上升趋势[1-2]，全球每年肿瘤新增患者数量亦在不断增加，增加治愈率、延长患者寿命及减轻患者痛苦是医疗工作者共同追求的目标，科研工作者们为寻找高效、毒副作用小、抗肿瘤普广的抗肿瘤药物不懈奋斗。顺铂是临床化疗首选药物，但是在应用顺铂过程中,人体出现了一系列严重的不良反应，长期应用也可出现明显的耐药性，这些都对铂类抗肿瘤药物的广泛使用造成了束缚。近年来，抗肿瘤活性强、抗肿瘤谱广且毒副作用小的新金属类抗肿瘤药成为了研究热点。

钌元素具有与铂类金属类似的理化特性，但毒副作用更低，被认为经过适当结构修饰后最具前途的抗肿瘤药物之一。NAMI-A及KP1019 2个钌配合物成功进入临床试验，更是激发了人们对钌金属的极大研究热情[3]。近年来，钌多吡啶配合物抗肿瘤活性的研究引起国内外学者的关注，很多研究结果表明钌多吡啶配合物对多种肿瘤细胞活性有明显的抑制作用。我们课题组在前期工作中，观察了多种新合成钌多吡啶配合物的抗肿瘤活性[4-6]。本实验将在原有工作基础上，新合成钌多吡啶配合物[Ru(phen)2(taptp)](ClO4)2(简称Ru1)，进一步研究其对胃癌SGC-7901细胞活性抑制率、细胞数量及凋亡的影响，所得实验结果可为钌配合物的研究奠定基础，为设计开发、筛选高效和毒副作用低的金属类抗肿瘤药提供宝贵的理论和实验依据。

材 料 和 方 法

1 细胞株、主要试剂和仪器

人胃癌SGC-7901细胞、人宫颈癌Hela细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞购自武汉大学细胞保藏中心。 DMEM 培养基(Gibco)；新生牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)；MTT试剂和Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒(Biosharp)。 MCO-15AC 型CO2细胞培养箱(Sanyo)； SW-CJ-1C 型细胞培养超净台( 苏州安泰空气净化有限公司)； Vrioskan Flash 型 酶 标 仪 (Thermo)；BX51 型倒置荧光显微镜(Olympus)；C6 型流式细胞仪(BD)。

2 主要方法

2.1MTT实验方法 细胞经过不同浓度(5、10、20、40、80 μmol/L)的Ru1处理24 h后，弃去各孔培养液，在尽量避光条件下加入MTT溶液，再于培养箱中孵育5 h。培养结束后，用移液器小心吸去MTT溶液，用排枪向每孔内加入150 mL DMSO。将96孔板置于微孔板摇床上振荡，直至甲臜完全溶解(约10 min左右)，而后将微孔板置于酶标仪中，在490 nm波长处检测各孔的吸光度(A)值，重复测定3次。通过统计学方法计算钌配合物对各种细胞的活性抑制率。

2.2结晶紫染色实验 取对数生长期肿瘤细胞，洗涤并消化。将细胞团吹打成单细胞，计数，将细胞密度调整为5×107/L，充分混匀后，按每孔2 mL的量将细胞接种于6孔板中。接种结束后，将6孔板转移至细胞培养箱中培养24 h。加入含Ru1的培养液，终浓度依次为：10、20和40 μmol/L，每孔加入的量为2 mL，同时设立对照组(只加2 mL培养液)。24 h后，弃去各孔培养液，用4 ℃预冷的PBS洗2遍，每遍5 min，加入含有150 μmol/L NaCl的4%多聚甲醛溶液固定细胞30 min；固定结束后，立即加入800 μL结晶紫染色液，室温染色15 min。染色结束后，用PBS洗涤以洗去过量的结晶紫染料。将染色后的6孔板置于室温下自然风干，加入3 mL体积分数为33 %的乙酸溶液以溶解固定细胞中的结晶紫，将孔中溶液全部收集至比色皿中，设定分光光度计的波长为550 nm，测定收集到的各孔乙酸溶液的A值。

2.3细胞凋亡实验 在6孔板中以每孔(3～4)×105个细胞的量接种所需细胞，待细胞贴壁后吸出原来的培养液，加入终浓度为10、20和40 μmol/L的Ru1的培养液，每孔加入的量为1 mL，放入细胞培养箱中继续培养24 h，洗涤、消化制备成单细胞悬液，将细胞悬液全部转移到2 mL EP管中离心5 min，弃上清。加入2 mL预冷的PBS洗1次，离心重悬后再用1×Binding Buffer洗1次，离心弃上清。单细胞用1×Binding Buffer重悬，向细胞悬液中加入5 μL AnnexinⅤ-FITC染色液，室温条件下避光孵育5 min，再直接加入5μL PI染色液(PI：1g/L)。15 min后，细胞悬液过300目筛装入FACS管，即可使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

2.4采用 Western blot技术检测相关蛋白表达 利用RIPA 裂解法提取蛋白，收集细胞总蛋白进行电泳。电泳完成后采用半干法进行转膜，转膜后用5%脱脂奶粉室温下孵育封闭2 h，封闭结束后，TBST洗涤3遍，每遍5 min，按照抗体说明书稀释要求，用5%BSA稀释Ⅰ抗至相应的浓度，加入孵育盒中浸没NC膜，4 ℃摇床中振荡过夜。次日，用TBST洗涤3遍，每遍5 min。用5%脱脂奶粉液稀释Ⅱ抗至1∶1 000，孵育1 h，采用 ECL 化学发光法进行显影后压片，采用相关图像分析软件进行图像分析，测定灰度值，计算目的蛋白与内参照的相对比值。

3 统计学处理

使用SPSS 12.0 统计学软件进行统计分析，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组之间比较采用单因素方差分析 (one-way ANOVA ), 组间两两比较采用 SNK-q检验, 以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 Ru1对SGC-7901、Hela和MDA-MB-231细胞活性抑制率的影响

MTT实验结果显示, SGC-7901细胞在经5、10、20、40和80 μmol/L Ru1处理24 h后，细胞活性抑制率分别为：(22.4±1.8)%、(32.5±0.8)%、(46.9±1.6)%、(51.9±0.8)%和(55.8±0.7)%；Hela细胞在经5、10、20、40和80 μmol/L Ru1处理24 h后，细胞活性抑制率分别为：(9.7±2.2)%、(22.6±4.2)%、(28.9±3.2)%、(33.9±3.9)%和(44.2±1.4)%；MDA-MB-231细胞在经5、10、20、40和80 μmol/L Ru1处理24 h后，细胞活性抑制率分别为：(9.8±4.9)%、(17.8±3.6)%、(26.1±3.2)%、(31.0±4.3)%和(41.2±1.9)%；绘制的抑制曲线图见图1。通过以上MTT实验结果得知，Ru1对3种肿瘤细胞系SGC-7901、Hela和MDA-MB-231均表现出了细胞活性抑制作用，且这种抑制作用呈剂量依赖性，其中Ru1对SGC-7901细胞活性抑制效果最佳。

Figure 1. The inhibition rate of viability in SGC-7901, MDA-MB-231 and Hela cells treatement with different concentrations of Ru1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

图1 不同浓度钌配合物对3种肿瘤细胞活性的抑制率

2 Ru1减少SGC-7901细胞数量

本实验选择对Ru1较为敏感的SGC-7901细胞，经一定浓度的配合物处理后，进行结晶紫染色。实验结果显示，随着配合物浓度升高，可见孔板中结晶紫染色变浅，可说明孔中细胞数减少；经33% 乙酸溶液洗脱后，测定吸光度值，可见吸光度值也随配合物浓度浓度升高呈下降趋势(P<0.05)，见图2。

3 Ru1促进SGC-7901细胞凋亡作用

经流式细胞仪检测所得散点图，散点图由4个象限的细胞分布图组成，每个象限的代表意义为：左下象限代表活的细胞，右下象限代表早期凋亡的细胞，右上象限代表晚期凋亡的细胞，左上象限表示在处理制备单细胞过程中人为造成机械性坏死的细胞。早期凋亡率与晚期凋亡率组成单次实验凋亡率。

凋亡实验结果显示，Ru1(10、20和40μmol/L)作用24 h后可导致SGC-7901细胞出现明显的凋亡,与正常对照组相比，10、20和40 μmol/L 的Ru1处理组细胞凋亡率均升高(P<0.05)，见图3、表2。由结果表明，Ru1可导致SGC-7901细胞凋亡，而且这种致凋亡作用呈剂量依赖性。

Figure 2. Crystal violet staining result of SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图2 SGC-7901细胞结晶紫染色形态图及吸光度值结果

4 Ru1上调Bax蛋白的表达和下调Bcl-2蛋白的表达

本实验Western blot 检测结果显示，Ru1(10、20和40 μmol/L)作用SGC-7901细胞24 h，与对照组相比，Bcl-2蛋白的表达呈下降趋势(随浓度升高而下降)，但Bax蛋白的表达呈剂量依赖性上调(P<0.05)。以上结果提示，Ru1可通线粒体途径诱导SGC-7901细胞凋亡，见图4。

讨 论

钌元素具有与铂类金属类似的理化特性，随着对钌金属认识的逐步深入，交叉学科研究不断增加，有关于钌金属的报道也在慢慢积累。大量的文献观点认为，钌金属配合物易被肿瘤组织吸收，同时具备毒副作用小、在体内排泄快等优点[7]，有部分专家学者预计钌及其配合物有可能成为最有前途的抗肿瘤药物之一。近期，不断涌现出了对各类新型钌配合物的研究[8-10]。

Figure 3. Apoptosis of SGC-7901 cells by Annexin V-FITC/PI staining.

图3 Annexin V-FITC/PI双染检测SGC-7901细胞凋亡

表1 钌配合物对SGC-7901细胞凋亡的影响

Table 1. The effect of Ru1 on apoptosis of SGC-7901 cells (%. Mean±SD.n=3)

Ru1(μmol/L)Normal cellsApoptotic cellsNecrotic cells094.4±3.12.5±1.03.1±1.21083.6±2.2 11.8±2.2∗4.5±1.42080.1±3.6 16.9±2.6∗∗3.1±1.44074.9±3.5 21.5±4.8∗∗3.7±1.5

*P<0.05，**P<0.01vs0 μmol/L group.

本课题组采用新型多吡啶配合物钌配合物[Ru(phen)2(taptp)](ClO4)2作用于SGC-7901、Hela和MDA-MB-231细胞，通过MTT实验和结晶紫染色实验探究该配合物对这3类肿瘤细胞活性抑制率及细胞数量的影响。实验结果说明，Ru1对目标细胞均有细胞毒性作用，均可降低细胞的活性及细胞数量，且抑制效应具有浓度依赖性，这种效应在不同细胞之间效果不一。通过比较发现Ru1对SGC-7901细胞的活性抑制效果最强。

Figure 4. The effect of Ru1 on the Bcl-2 and Bax expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L Ru1 group.

图4 钌配合物对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

在实验中，SGC-7901细胞经Ru1处理24 h后，细胞凋亡率呈浓度依赖性上升，实验说明Ru1可致肿瘤细胞凋亡。Bcl-2蛋白家族由抗凋亡与促凋亡因子组成，Bcl-2家族蛋白可通过控制线粒体膜通透性调节细胞凋亡，抗凋亡分子如Bcl-XL和Bcl-2可阻抗药物诱导细胞凋亡的发生，促凋亡分子如Bax和Bad通过与渗透性转换孔复合物发生结合促进药物诱导细胞凋亡的发生。我们利用Western blot 检测发现，钌配合物(10、20和40 μmol/L)作用SGC-7901细胞24 h，Bcl-2蛋白的表达呈下降趋势(随浓度升高而下降)，但Bax蛋白的表达呈剂量依赖性上调，差异有显著意义，为下一步研究Ru1抗肿瘤机制提供了重要依据。后续实验将通过检测细胞周期其它相关蛋白表达的变化，以进一步探讨该配合物可能的抗肿瘤机制。希望能够在这些实验成果上进一步探讨其体外抗肿瘤作用的其他潜在机制以及对体内实体瘤的抑制效应，为新型钌配合物的设计、开发提供更多的实验依据。