链式激活诱导免疫细胞联合化疗对恶性实体肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群及肿瘤标志物的影响

梁文龙，吴学琼，孟昭升

(淄博市中心医院，山东淄博255020)

链式激活诱导免疫(CAPRI)细胞治疗是恶性肿瘤的一种新型过继T细胞治疗方式，其效应细胞包括NK细胞、树突状细胞、CD4+T细胞及CD8+T细胞等；该治疗可诱导抑制性调节性T细胞明显下降，同时诱导肿瘤细胞表达MHC-Ⅰ类及Ⅱ类分子明显增加，显著提高机体的抗肿瘤能力[1]。近年来，CAPRI细胞治疗对恶性肿瘤安全、有效的报告逐渐增多。为此，我们选取45例恶性肿瘤患者行CAPRI细胞治疗联合常规化疗，观察治疗前后患者T淋巴细胞亚群及肿瘤标志物的变化，分析CAPRI细胞治疗联合化疗对恶性肿瘤的临床疗效。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2011年3月～2016年4月淄博市中心医院收治恶性实体肿瘤患者90例，男53例、女37例；其中胃腺癌25例，乳腺癌25例，肺腺癌19例，结肠癌21例。患者临床均有不同程度的腹痛、腹泻、肠梗阻、咳嗽、胸闷等症状，并经医学影像学检查及病理检查确诊。纳入标准：组织病理学确诊病例，预计生存期大于4周，自愿参与该临床研究。排除标准：服用免疫抑制剂，活动性感染，自身免疫性疾病及糖尿病，癫痫病史。90例随机分为两组。观察组男24例、女21例，年龄38～85岁，中位年龄53岁；其中胃腺癌13例，乳腺癌12例，肺腺癌11例，结肠癌9例。对照组男29例、女16例，年龄36～83岁，中位年龄49岁；其中胃腺癌12例，乳腺癌13例，肺腺癌8例，结肠癌12例。两组患者性别、年龄及肿瘤构成均无统计学差异(P均>0.05)。本研究经本院伦理委员会审核批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 治疗方法 对照组接受常规化疗。胃腺癌采用奥沙利铂130 mg/m2静滴(疗程第1天)+卡培他滨1 000 mg/m2口服(2次/d，疗程第1～14天)方案。乳腺癌采用阿霉素60 mg/m2静滴(疗程第1天)+环磷酰胺600 mg/m2静滴(疗程第1天)+多西紫杉醇75 mg/m2静滴(疗程第1天)方案。肺腺癌采用培美曲塞500 mg/m2静滴(疗程第1天)+顺铂75 mg/m2静滴(疗程第1天)方案，结肠癌采用奥沙利铂85 mg/m2静滴持续2 h(疗程第1天)+亚叶酸钙200 mg/m2(疗程第1～2天)+5-氟尿嘧啶400 mg/m2静滴(疗程第1～2天)+5-氟尿嘧啶600 mg/m2泵入持续44 h。以上治疗21 d为1个疗程，连续4个疗程。观察组接受常规化疗(治疗方式同对照组)后2周，序贯进行CAPRI细胞治疗。治疗前，先制作CAPRI细胞。应用COBE spectra血细胞分离机采集患者外周血单个核细胞液约40 mL，细胞数约5×108个，进行淋巴细胞纯化。纯化后的淋巴细胞加无血清培养基至50 mL，其中25 mL加入包备好的培养瓶中(共分5瓶，每瓶5 mL，再加无血清培养基至30 mL左右)放入培养箱(37 ℃、5%的CO2)中培养3 h，剩余25 mL 在离心管中放入离心机中避开紫外线照射。3 h后复苏CAPRI专利试剂A，分别加入到5个培养瓶中，每瓶加0.25 mL，再次于培养箱中培养3 h，完成CAPRI细胞的第一步激活；3 h后，剩余离心管中的25 mL溶液平均分装于上述5个培养瓶中，再次放入培养箱中培养16～24 h，完成第二步激活。然后将得到的细胞计数，离心后加入CAPRI专利试剂B培养72 h，离心去上清，得到CAPRI细胞，并将获得的CAPRI细胞进行质控、细菌监测及冻存。CAPRI细胞治疗时，先应用37 ℃恒温水浴箱复苏细胞，并应用细胞复苏液重悬细胞，然后回输相应患者体内。隔日回输1次，每个疗程回输12次，连续4个疗程。

1.3 检测方法 ①T淋巴细胞亚群检测：经外周静脉抽取患者外周血3 mL 至EDTA抗凝管中，取20 μL CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP试剂+100 μL EDTA抗凝全血，混匀，避光反应15 min；加2 mL溶血素(1∶9稀释配制)，混匀，避光反应10 min，观察其透明度，1 300 r/min离心5 min；弃去上清液，加少量缓冲液，采用流式细胞仪分析患者CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞的百分率。②肿瘤标志物检测：经外周静脉抽取患者外周血2 mL至无添加剂的试管中，应用全自动生化分析仪以电化学发光技术检测血清CEA、NSE 、CA72-4 、CA19-9浓度，试剂及仪器均为罗氏公司产品。

2 结果

2.1 两组治疗前后T淋巴细胞亚群构成比较 两组患者治疗前T淋巴细胞亚群构成无统计学差异(P均>0.05)。治疗后，观察组CD3+CD4+T淋巴细胞比例较治疗前升高，CD3+CD8+T淋巴细胞比例较治疗前下降(P均<0.05)；对照组治疗前后T淋巴细胞亚群比例无变化(P均>0.05)。见表1。

表1 两组治疗前后T淋巴细胞亚群构成比较

注：与本组治疗前比较，*P<0.05。

2.2 两组治疗前后肿瘤标志物水平比较 两组治疗后CEA、NSE、CA19-9均较治疗前下降(P均<0.05)，但观察组较对照组下降更明显(P均<0.05)。两组治疗前后CA72-4水平无变化(P均>0.05)。见表2。

表2 两组治疗前后肿瘤标志物水平比较

注：与本组治疗前比较，*P<0.05；与对照组治疗后比较，#P<0.05。

2.3 两组不良反应发生率比较 对照组出现白细胞下降15例(33.3%)，血小板下降12例(26.7%)，恶心呕吐26例(57.8%)，肝功能损害3例(6.7%)；观察组出现白细胞下降16例(35.6%)，血小板下降15例(33.3%)，恶心呕吐24例(53.3%)，肝功能损害4例(8.9%)。两组上述不良反应发生率未见统计学差异(P均>0.05)。同时观察组未发现CAPRI细胞输注过程中有发热、寒战、胸闷、低血压等过敏反应发生。

3 讨论

随着细胞免疫学、分子生物学等研究领域的发展，目前实体肿瘤的治疗已经由传统的手术、放化疗治疗模式向包含靶向治疗、免疫治疗在内的综合治疗模式转变。T淋巴细胞是机体免疫防御系统的重要组成部分。研究发现，肿瘤患者常处于免疫功能低下状态，表现为T淋巴细胞亚群比例失调，免疫抑制因子升高和(或)免疫促进因子表达降低。其特征是患者体内CD3+CD4+细胞明显减少，而CD8+细胞明显增加，CD4+/CD8+比值显著降低，细胞免疫功能处于免疫抑制状态，患者免疫系统识别和杀伤突变细胞的能力下降，形成了肿瘤的生长转移[2，3]。

免疫细胞治疗经历了LAK细胞、CIK细胞等治疗方式的变迁，这些治疗方式的效应细胞只能杀伤非MHC限制型肿瘤细胞，其杀伤作用缺乏特异性[4]。CAPRI细胞治疗是一种新型的过继性细胞免疫治疗方法，其利用抗原递呈细胞结合抗CD3单抗及特定细胞因子，然后经两步法链式激活后获得，效应细胞包括CD4+辅助性T细胞(Th)、CD8+杀伤性T细胞(CTL)、NK样T淋巴细胞、NK细胞和树突状细胞等。其对肿瘤细胞的作用机制包括：①分泌肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN-γ)及IL-2、IL-6等多种抗肿瘤的细胞因子，其中TNF主要由Th细胞分泌，IL-2主要由CD4+和CD8+T淋巴细胞分泌，而IFN-γ主要是由CD8+T淋巴细胞和NK细胞分泌；②诱导肿瘤细胞凋亡；③通过特异性杀伤细胞诱导肿瘤细胞裂解。CAPRI细胞80%的杀伤活性由Th细胞和CTL细胞完成[5]。Th细胞和CTL细胞的杀伤是典型的MHC限制型特异性杀伤。体外实验及临床实验均证实CAPRI的杀伤效果优于CIK[6，7]。CAPRI细胞治疗后可明显观察到CD4+T淋巴细胞的升高，提示机体免疫功能的恢复[7～9]。因此T淋巴细胞亚群检测对判断肿瘤患者的免疫功能有指导作用[10]。我们同样观察到观察组患者CAPRI细胞治疗后CD3+CD4+T淋巴细胞的明显升高，证实了CAPRI细胞对机体抗肿瘤免疫能力的提升作用。

肿瘤负荷大小与病情进展速度及患者最终生存结局均有关。当肿瘤细胞增殖迅速时，大量肿瘤标志物分泌于血清中并被检测到，故肿瘤标志物含量可间接反映肿瘤负荷[11]。有研究显示，血液CEA联合CA19-9检测对判断胃癌的预后有一定价值[12]，CEA联合NSE检测可作为肺癌疗效判定的良好指标[13]，CEA、CA19-9及CA72-4检测对结肠癌患者的诊断有重要作用[14]，CA72-4对乳腺癌的诊断价值较大[15]。本研究观察组治疗后血清CEA、NSE、CA19-9均显著下降，提示患者肿瘤负荷明显减低，治疗有效。由于这三种肿瘤标志物特异性并不强，目前不能明确哪种肿瘤在CAPRI细胞治疗后获益更明显。Wank等发现乳腺癌患者应用CAPRI细胞治疗后明显获益，生存期显著延长，但其治疗周期需要持续5年[6]。此次观察组未观察到乳腺癌相关标志物CA72-4在治疗后出现显著下降，可能与CAPRI细胞治疗疗程不足或观察时间过短有关。

综上所述，CAPRI细胞治疗在短期内可明显提高肿瘤患者的免疫功能，降低患者的肿瘤负荷，患者临床症状明显改善。但本研究病例少、疗程短，后期有待于扩大样本量及增加疗程进一步观察；同时针对治疗前后各项肿瘤标志物的变化指导临床治疗，筛选出真正适合CAPRI细胞免疫治疗的人群，确定最佳疗程。