α倒捻子素与载α倒捻子素纳米制剂促进小胶质细胞摄取Aβ的作用比较

王大元，宋华华，胡朦，李娟，谷晓，高小玲

(上海交通大学医学院药理与化学生物学系，上海 200025)

阿尔茨海默病(AD)是一种最常见的神经退行性疾病，65岁以上老年人患病率为10%～30%[1]，而且仍以10万人/年的速度增加，预期到2050年将达1.31亿[2]。AD患者脑内会产生大量异常聚集的β-淀粉样蛋白(Aβ)，对神经细胞有较大毒性，是导致和加剧AD症状的关键因素[3, 4]。因此，促进Aβ的清除成为缓解甚至治疗AD的有效方法。目前Aβ清除策略主要是通过主动免疫的疫苗或被动免疫的抗体介导清除。虽然这些方法可以起到一定Aβ清除效果，但仍会引起自身免疫性脑膜炎以及小胶质细胞激活[5, 6]。此外，这些Aβ抗体还可能同正常神经元的Aβ前体蛋白结合而导致正常神经元遭受免疫攻击[5]。鉴于目前免疫疗法仍存在严重的不良反应，我们考虑是否可以利用机体自身Aβ清除机制为Aβ清除提供一个更安全有效的方法。我们的前期研究显示，山竹壳提取物多酚黄酮类衍生物α倒捻子素(αM)可以上调低密度脂蛋白受体的表达，在脑内和外周分别增强小胶质细胞和肝脏细胞对Aβ的清除;然而αM等多酚类物质在体内稳定性差、溶解度低，在靶器官药物浓度低。进一步研究发现，将αM包载入聚乙二醇聚乳酸(PEG-PLA)纳米制剂后可以克服这些问题。因此，我们在体外比较αM和载αM的PEG-PLA(NP-αM)对小胶质细胞摄取Aβ的促进效果，从而为AD提供一种以促进Aβ清除为策略的纳米药物疗法。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠BV2小胶质瘤细胞系(购自中科院北京细胞库)、小鼠原代小胶质细胞取自新生24 h的C57BL/6小鼠(小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司)；MePEG3000-PLA4000由华东理工大学赠送；αM、香豆素6荧光素、DAPI、PBS磷酸盐缓冲液购自美国Sigma-Aldrich公司；DMEM培养基(高糖)、胰酶、胎牛血清、链霉素-青霉素双抗、GlutaMAX购自美国Thermo Fisher公司；羧基荧光素标记的Aβ(Fam-Aβ)购自美国AnaSpec公司；胆酸钠购自中国医药集团上海化学试剂公司；磷钨酸购自上海大合化学；HPLC用甲醇、HPLC用乙腈购自美国TEDIA 公司。

1.2 纳米制剂的制备 ①空载PEG-PLA纳米制剂(NP)制备：电子天平称取20 mg MePEG-PLA后加入1 mL二氯甲烷中。待固体物质溶解后，加入2 mL 1 %胆酸钠水溶液。220 W超声处理约3 min使其形成O/W乳液，该过程在冰上进行以吸收探针超声产生的热量。取18 mL 0.5 %胆酸钠水溶液加入超声处理乳液中，使用磁力搅拌器系统搅拌5 min。使用旋转蒸发仪蒸发至不再产生气泡，14 000 g离心45 min。加入1 mL生理盐水复溶，保存于4 ℃冰箱中。②载αM的PEG-PLA 纳米制剂(NP-αM)制备：采用乳化-溶剂蒸发法。称取1 mg αM和20 mg MePEG-PLA，然后加入到1 mL的二氯甲烷中。待固体物质溶解后，向其中加入2 mL 1 %胆酸钠水溶液。为了将其制成O/W乳液，进行220 W超声处理，此过程需要约3 min，在冰上进行以吸收探针超声产生的热量力。将18 mL 0.5 %胆酸钠水溶液加入到超声处理乳液中，并使用磁力搅拌器系统搅拌5 min。使用旋转蒸发仪蒸发至不再产生气泡，14 000 g离心45 min。最后，使用1.5 cm×20 cm Sepharose琼脂糖凝胶CL-4B柱除去未包裹的αM。使用香豆素6(Cou6)分别标记NP和NP-αM，并以其分别作用BV2细胞和原代小胶质细胞。

1.3 纳米制剂表征方法 使用Zetasizer粒径电位仪测定纳米制剂光散射粒径和zeta电位。①NP浓度使用浊度法测定：首先使用甲醇配制0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mg/mL的纳米制剂标准液，350 nm UV下检测吸光度并绘制标准曲线。纳米制剂稀释20倍后使用350 nm UV检测吸光度，代入标准曲线线性方程计算纳米制剂的浓度。②NP-αM中的αM浓度使用HPLC检测：选取甲醇0.5、1、2.5、5、10 μg/mL αM标准液，乙腈溶解并稀释NP-αM 100倍，静置5 min后取上清液100 μL作进样用。HPLC的操作参数如下：使用C18反相色谱柱，紫外检测波长为325 nm，甲醇为流动相，5 mmol/L pH 3.0的甲酸铵为水相，比例为94∶6；流速1 mL/min；进样体积20 μL。以标准曲线溶液测得的峰面积作为纵坐标，以标准曲线浓度作为横坐标绘制标准曲线，将纳米制剂测得的峰面积代入标准曲线方程中计算NP-αM中αM的浓度。制剂的包封率和载药量采用以下公式计算： 载药量(%)：C1×N/C2×100；包封率(%)：C1×N/C2/(m1/m2)×100。其中，C1为HPLC测得的αM浓度，N为检测时的稀释倍数，C2为NP的浓度，m1为αM的投药量，m2为NP的投入量。

1.4 原代小胶质细胞提取和培养 原代小胶质细胞取材于野生型出生24 h的C57BL/6小鼠。首先使用75 %乙醇棉球消毒头部，断头剥除脑壳和脑膜，取出大脑皮层部分，放于冷的DMEM中(于冰上操作)。小心剥离皮层组织上的血管膜和非皮层脑组织，使用消毒后的专用剪刀剪碎皮层。使用胶头滴管将皮层组织转移至盛有5 mL 0.25 % 胰蛋白酶的平皿中，于37 ℃消化5 min。将消化后的皮层转移至装有10 mL完全培养液的50 mL离心管中终止消化，向其中加入 10～20 μL的DNA酶减轻黏稠度，轻柔吹打20次左右。接着使用离心机1 600 r/min 离心5 min，弃去上清液，用5 mL完全培养液重悬沉淀，使用血球计数板对细胞悬液进行计数，稀释至合适的浓度后，种植于使用多聚赖氨酸包被后的75 cm2的细胞培养瓶中。第2天换新的完全培养液，往后每隔3 d使用完全培养液半量换液，到第7天时进行摇取胶质细胞的步骤。摇取胶质细胞前，先将培养瓶用封口膜封口并固定在摇床上，将条件设定为200 r/min，37 ℃。摇取3.5 h后将培养瓶取出，吸取上层培养液并加入2 mL完全培养液，轻柔吹打成细胞悬液。取少量细胞悬液使用0.4 %台盼蓝染色以区别死细胞，在显微镜下进行细胞计数。按照需要的细胞浓度加入一定体积的完全培养液，按照5×103个/孔的种植密度种于多聚赖氨酸包被过的96孔板中，最后放入CO2培养箱培养，48 h后可以用于后续实验。

1.5 小胶质细胞摄取纳米制剂的荧光共聚焦显微镜观察 使用多聚赖氨酸包被玻璃底96孔盘(荧光共聚焦显微镜专用)，小胶质细胞(BV2或原代小胶质细胞)的种植密度为5×103个/孔，贴壁后且状态良好方可用于实验。称取1 mg αM加入到1 mL DMSO中溶解，作为给药储备液。各组制剂或药物使用DMEM稀释至所需浓度，含有DMSO药物在稀释时要使得DMSO在培养液中的含量小于0.1 %。实验分3组，NP(NP，15 μg/mL)组、αM+NP(αM，400 ng/mL；NP，15 μg/mL)组、NP-αM(含400 ng/mL αM和15 μg/mL NP)组。在37 ℃细胞培养箱中孵育24 h。接着，使用PBS清洗细胞3遍，在37 ℃下使用4 %甲醛固定细胞10 min，PBS清洗细胞3遍，DAPI染核液先稀释至0.5 mg/mL，与细胞在室温避光孵育30 min，PBS清洗细胞3次，每次时间为5 min。制备好的细胞样本用Leica TCS SP8激光共聚焦显微镜观察采集照片，激发光波长分别为405、488 nm。

1.6 小胶质细胞摄取纳米制剂或Aβ定量检测 小胶质细胞(BV2或原代小胶质细胞)种于多聚赖氨酸包被的96孔板中，种植密度为5×103个/孔，贴壁后且状态良好方可用于实验。称取1 mg αM加入到1 mL DMSO中溶解，作为药物储备液。各组制剂或药物使用DMEM稀释至所需浓度，含有DMSO药物的在稀释时要使得DMSO在培养液中的含量小于0.1 %。①纳米制剂的摄取：实验分为3组，NP(NP，15 μg/mL)组、αM+NP(αM，400 ng/mL ；NP，15 μg/mL)组、NP-αM(含15 μg/mL NP和400 ng/mL αM)组，各组在37 ℃细胞培养箱中孵育24 h。②Aβ的摄取：实验分为4组，Aβ(Aβ，2 μg/mL)组，NP+Aβ组(NP，15 μg/mL；Aβ，2 μg/mL)，αM+Aβ组(αM，400 ng/mL；Aβ，2 μg/mL)，NP-αM+Aβ组(NP-αM，含15 μg/mL NP和400 ng/mL αM；Aβ，2 μg/mL)。在37 ℃细胞培养箱中孵育23 h后，加入Fam-Aβ继续共同孵育1 h。上述药物作用结束后，使用PBS清洗细胞3遍，在37 ℃下使用4 %甲醛固定细胞10 min，PBS清洗细胞3遍，DAPI染核10 min，PBS清洗细胞3遍，最后使用高内涵扫描系统进行定量分析。

2 结果

2.1 纳米制剂表征 制备NP-αM粒径为(150.1±14.6)nm，分散系数(PDI)为0.102±0.025， zeta电位为(-14.28±2.83)mV。NP粒径为(141.6±15.2)nm，PDI为0.110±0.021，zeta电位为(-14.59±2.31)mV。NP-αM的载药量为(2.60±0.22)%，包封率为(53.6±4.7)%。透射电子显微镜下NP和NP-αM图像见图1。

图1 透射电子显微镜下NP(A)和NP-αM(B)图像

2.2 αM与NP-αM促进小胶质细胞摄取Aβ定量比较 高内涵扫描系统检测结果显示，与Aβ组比较，NP-αM+Aβ组和αM+Aβ组可以促进BV2细胞或原代小胶质细胞对Aβ的摄取(P均< 0.05)，但与αM+Aβ组相比，NP-αM+Aβ组作用更显著(P< 0.05)。见表1。

表1 αM与NP-αM促进小胶质细胞摄取Aβ定量比较

注：与Aβ组比较，*P< 0.05；与αM+ Aβ组比较，△P< 0.05；表中数据为细胞内纳米制剂Fam荧光量。

2.3 αM或NP-αM影响小胶质细胞摄取纳米制剂定性观察 荧光共聚焦显微镜观察显示， 与NP组比较，NP+αM组或NP-αM组BV2细胞或原代小胶质细胞摄取的纳米制剂较多。见图2。

图2 荧光共聚焦显微镜下BV2细胞(A)和原代小胶质细胞(B)摄取NP图像

2.4 αM与NP-αM促进小胶质细胞摄取纳米制剂定量比较 高内涵扫描系统定量检测发现，αM+NP或NP-αM均可以显著促进BV2细胞或原代小胶质细胞摄取纳米制剂。αM+NP组相对于NP组，BV2细胞和原代小胶质细胞对NP摄取量分别提高了5.5倍和3.9倍；NP-αM组相对于NP组，BV2细胞和原代小胶质细胞对NP的摄取量分别提高了6.6倍和4.5倍，组间比较差异均有统计学意义(P均< 0.05)。见表2。

表2 αM与NP-αM促进小胶质细胞摄取纳米制剂定量比较

注：与NP组比较，*P< 0.05；与αM+NP组比较，△P< 0.05；表中数据为细胞内纳米制剂Cou6荧光量。

3 讨论

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻细胞，占全部细胞的5%～12 %[7]。小胶质细胞参与神经系统的建立(如突触修剪等)[8～10]；在大脑受到损伤时，小胶质细胞参与损伤修复[11, 12]；作为中枢神经系统的巨噬细胞，小胶质细胞还具有监视和清除脑内废物的功能[13～15]。小胶质细胞对AD的发生发展也发挥许多重要作用，可以通过释放炎症调节因子参与疾病进程[16]。Aβ大量聚集是AD的关键致病因素，小胶质细胞对Aβ清除也发挥关键作用[7, 17, 18]。

研究发现，山竹壳提取物多酚黄酮类衍生物αM可以上调低密度脂蛋白受体的表达，在脑内和外周分别增强小胶质细胞和肝脏细胞对Aβ的清除[19, 20]，αM可作为一种能促进小胶质细胞清除Aβ的潜在候选药物。但是，αM等多酚类物质在体内稳定性差、溶解度低，特别是在靶器官的药物浓度低等缺点大大限制了其后续研究和应用[21]。而将αM包载入PEG-PLA纳米制剂后，可以克服这一问题。但是包载后的αM促进小胶质细胞清除Aβ的效果与αM单独作用相比会发生何种改变还不清楚。因此，我们首先制备了NP和NP-αM制剂，从表征中可以看出纳米制剂的稳定性较好，大小均一，分散均匀。继而，我们探究NP-αM对小胶质细胞摄取Aβ的促进作用，并与αM单独作用的效果进行比较。将αM和NP-αM分别作用于BV2细胞或原代小胶质细胞后，发现αM和NP-αM均可以显著促进细胞摄取Aβ，但NP-αM比αM的作用更强。这一结果表明，αM促进小胶质细胞清除Aβ的效果在包载入纳米制剂后有了显著提升。由于αM和NP-αM的给药浓度、时间均相同，而空白NP未促进小胶质细胞摄取Aβ，因此我们继续探究是何种原因导致了NP-αM的摄取促进效果。我们利用共聚焦显微镜定性观察和高内涵扫描系统定量检测后均发现，αM或NP-αM均可以显著增强小胶质细胞对纳米制剂的摄取。NP-αM作用后，其内所含的αM除了发挥促进小胶质细胞摄取Aβ的作用外还促进了小胶质细胞摄取更多的纳米制剂，而这些纳米制剂中包载了αM，更多的αM进入细胞，最终产生了更强促Aβ摄取的药效。因此认为NP-αM相比于αM可以更好地发挥促进小胶质细胞摄取Aβ的作用，这一作用是由于αM可以促进小胶质细胞摄取更多的纳米制剂从而使更多的αM进入细胞的结果。纳米药物具有众多普通药物无法实现的功能和优势，可以增强水溶性差药物的溶解度、提高药物生物利用率和体内分布率、延长药物的体内半衰期、消除血脑屏障对药物作用的限制等。因此，NP-αM有望为AD提供一个以纳米药物为基础、以Aβ清除为策略的更好治疗方法。