血清总同型半胱氨酸水平与缺血性卒中患者颈内动脉颅内段钙化的关系

张彩宾 王俊峰 雷俊杰 方义杰 莫志怀

中山大学附属第五医院1神经内科，2影像科（广东珠海519000）

同型半胱氨酸是动脉粥样硬化的危险因素，也是卒中的独立危险因素［1］，其浓度升高与缺血性卒中的关系密切［2］。血管钙化是动脉粥样硬化中普遍存在的病理过程，尤其多见于进展性斑块中［3］，大量证据表明血管钙化是预测心血管急性事件［4］、脑卒中［5］发生的重要指标。而同型半胱氨酸与动脉钙化亦存在密切关联，研究［6-10］表明血清同型半胱氨酸水平升高与颅外颈动脉、脑动脉、冠状动脉和腹主动脉钙化发生率增加有关。尽管已知颈内动脉颅内段（intracranial internal carotid artery，iICA）钙化是一般人群卒中重要的独立危险因素［11］，但目前对iICA 钙化与血清同型半胱氨酸之间的关系研究较少。本研究对428 例急性缺血性卒中患者的临床资料进行回顾性分析，通过图像处理软件ImageJ 半自动测量患者头颅CT 片的iICA 钙化容积积分，探讨血清总同型半胱氨酸（total homocysteine，tHcy）浓度与iICA 钙化之间的关系，为缺血性卒中与动脉钙化的预防和治疗提供更多的依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象连续收集2016年1月至2018年4月在本院诊断为急性缺血性卒中的住院患者的临床资料。入选标准：年龄18 ～80 岁，符合急性缺血性脑卒中的诊断标准（2014 版）。排除标准：（1）临床资料不完整或CT 图像不清晰者，临床资料包括实验室检验和头颅CT 影像学资料；（2）脑出血、严重全身性疾病患者如肿瘤、严重感染、肾功能衰竭。本研究主要临床指标及定义如下：高血压：接受降压药物治疗，或收缩压≥140 mmHg和（或）舒张压≥90 mmHg；糖尿病：使用降糖药物，或空腹血糖水平≥7.0 mmol/L 或餐后2 h 血糖水平≥11.1 mmol/L 或糖尿病症状并随机血糖≥11.1 mmol/L；冠心病史：心肌梗死或心绞痛病史。

1.2 研究方法

1.2.1 血清tHcy 浓度检测及分组于患者入院后第2 天清晨抽取空腹正中静脉血2 mL 置于含有EDTA的试管，然后离心机3 000 r/min离心5 min进行血浆分离，使用化学发光仪（ARCHITECT i2000SR，美国雅培公司）和配套的同型半胱氨酸试剂盒对血浆进行tHcy 浓度检测。根据tHcy 浓度将患者分为三分位组，T1 组（tHcy ≤9.90 μmol/L），T2 组（9.91 ～12.90 μmol/L），T3组（tHcy ＞12.90 μmol/L）。

1.2.2 CT 扫描方案采用SiemensSomatomSensation16 层螺旋CT。扫描参数为120 kV，260 mAs，B30 算法，层厚为1.5 mm，层间距1.5 mm。患者取常规仰卧位，头部平放，头部伸入扫描机架孔内。调整机架，使定位线与听眉线平行。先定位扫描，扫描头顶至听眉线以下2 cm。

1.2.3 iICA 钙化容积积分的评估和分组采用美国国立卫生院研究开发的图像处理软件ImageJ 1.52i 对DCM 格式影像图片进行颈内动脉颅内段海绵窦段钙化的容积评估，取钙化阈值为＞130 HU，调整窗位200 HU，窗宽800 HU，标记钙化灶后，自动测量每一薄层钙化面积，薄层图像钙化面积（A）之和与层厚（T）的乘积即为钙化容积积分。由笔者医院具有5年以上工作经验的1 名影像科医师和1 名神经内科医师分别测量双侧动脉钙化体积，两人分测结果取平均值，总体积相差10 mm3以上者重新测量后取均值。取钙化容积积分较高侧为最终积分，积分按四分位数分组，最高组（即积分最高的107 例，容积积分＞125 mm3）定义为“重度钙化”组，其他为非重度钙化组。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0 软件进行统计分析，连续变量用±s 描述，组间比较采用独立样本t 检验、单因素方差分析，为满足t 检验和方差分析的检验条件正态性和方差齐性要求，分别对总胆固醇、LDL-C、eGFR 进行平方根变换，对收缩压、舒张压、白细胞计数、HDL-C 进行自然对数转换，对甘油三酯进行常用对数转换，对体质指数进行倒数转换，年龄为原始数据，数据转换后满足检验条件；tHcy、钙化积分、空腹血糖不能转换为正态分布数据，组间比较采用秩和检验，用中位数（四分位间距）表示。为方便阅读，表格中的变量以原始数据表示。计数资料用例数和百分比表示，组间比较采用χ2检验，由于心房纤颤史例数较少，将其和冠心病史合并成心脏病史。单因素分析P＜0.1 的变量以进入法纳入多因素Logistic 回归分析，纳入变量经Box-Tidwell 法检验后均与因变量logitπ存在线性关系，满足Logistic 回归条件。对于tHcy，分别以连续变量和三分位组形式纳入回归分析，以验证tHcy 和iICA 钙化的相关性。所有变量均采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者的总体资料特征和tHcy三分位组间iICA钙化容积积分的比较研究最终入选428 例缺血性卒中患者，平均年龄（61.3 ± 10.9）岁，男288 例（67.3%），女140 例（32.7%）。在428 例患者中327例有iICA 钙化，占总患者76.4%。tHcy 三分位组比较显示，iICA 钙化积分随tHcy 浓度升高而升高（P = 0.062），重度钙化患病率随tHcy 浓度升高而增加（P=0.028）。见表1。

2.2 iICA 钙化的单因素分析iICA 钙化组与无钙化组比较，年龄、空腹血糖、体质量指数、舒张压、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、估计肾小球滤过率、吸烟史、糖尿病史差异有统计学意义，tHcy 和其他因素差异无统计学意义；iICA 重度钙化组与非重度钙化组比较，tHcy 和年龄、高血压史、糖尿病史、卒中史、收缩压、低密度脂蛋白胆固醇差异有统计学意义，其他因素差异无统计学意义（表2）。

2.3 iICA 钙化危险因素的多因素Logistic 回归分析多因素Logistic 回归分析显示，iICA 钙化与年龄、糖尿病独立相关（表3），回归模型解释了有无iICA 钙化的37.5%变异（Nagelkerke R2）并能够正确分类80.8%的研究对象（正确分类百分比）；iICA重度钙化独立危险因素为tHcy（高三分位组/低三分位组的OR = 2.12，95%CI 1.11 ～4.06，P = 0.023，表4）、年龄、糖尿病史、收缩压，回归模型解释了有无iICA 重度钙化的32.2%变异（Nagelkerke R2）并能够正确分类78.0%的研究对象（正确分类百分比）。

当tHcy 以连续变量进入Logistic 回归分析时，tHcy依然与iICA 重度钙化独立相关（OR=1.04，95%CI：1.01 ～1.07，Wald χ2=4.07，P=0.044）。

表1 患者总体资料特征和tHcy 三分位组间iICA 钙化容积积分的比较Tab.1 General characteristics of patients and comparison of iICA calcification volume score among tHcy tertiles ±s

表1 患者总体资料特征和tHcy 三分位组间iICA 钙化容积积分的比较Tab.1 General characteristics of patients and comparison of iICA calcification volume score among tHcy tertiles ±s

注：*P ＜0.05；tHcy 三分位组间比较重度钙化率，△P ＜0.017；eGFR 为估计肾小球滤过率，采用中国人改良MDRD 公式：eGFR= 175×血清肌酐（SCr）-1.234×年龄-0.179×0.79（女性）

年龄（岁）女性［例（%）］病史［例（%）］高血压糖尿病卒中史心脏病史吸烟史饮酒史体征体质量指数（kg/m2）收缩压（mmHg）舒张压（mmHg）实验室检查白细胞计数（×109/L）空腹血糖［M（P25，P75），mmol/L］甘油三酯（mmol/L）总胆固醇（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）eGFR［mL/（min·1.73 m2）］iICA 钙化钙化容积积分（mm3）［M（P25，P75），mm3］iICA 钙化［例（%）］重度钙化［例（%）］合计61.3±10.9 140（32.7）348（81.3）141（32.9）66（15.4）40（9.3）158（36.9）63（14.7）24.2±3.5 146.5±23.5 89.0±14.0 7.2±2.2 5.5（4.9，6.8）1.8±1.1 5.0±1.2 1.1±0.3 2.9±0.9 103.4±27.6 31（2，125）327（76.4）107（25.0）T1（n=143）61.1±10.6 83（58.5）112（78.9）40（28.0）13（9.2）13（9.2）34（23.9）10（7.0）24.2±3.8 145.0±23.1 87.2±13.1 6.9±2.0 5.6（5.0，7.5）1.7±0.9 5.1±1.1 1.1±0.3 2.8±0.8 113.4±28.2 27（0，104）105（73.9）29（20.4）△T2（n=143）60.7±11.1 32（22.4）118（82.5）46（32.2）23（16.1）9（6.3）54（37.8）23（16.1）24.1±3.0 145.7±24.7 89.7±14.8 7.1±2.2 5.4（5.0，6.8）1.8±1.2 5.0±1.2 1.0±0.2 2.9±0.9 104.4±24.3 28（2，98）106（74.1）31（21.7）T3（n=142）62.1±11.1 25（17.5）118（82.5）55（38.7）30（21.0）18（12.6）70（49.0）30（21.0）24.3±3.5 148.8±22.5 90.2±14.0 7.5±2.2 5.5（4.8，6.5）1.8±1.2 4.9±1.3 1.0±0.3 2.8±0.9 92.4±26.1 46（7，158）116（81.1）47（32.9）△F/χ2/H 值0.63 64.75 0.83 3.79 7.71 3.35 19.20 11.34 0.08 1.21 1.65 3.68 2.75 0.14 1.13 4.09 0.30 24.42 5.57 2.65 7.15 P 值0.531＜0.001*0.661 0.150 0.021*0.190＜0.001*0.003*0.925 0.301 0.194 0.026*0.253 0.872 0.325 0.017*0.739＜0.001*0.062 0.266 0.028*

表2 iICA 钙化的单因素分析Tab.2 Univariate analysis of intracranial internal carotid artery calcification ±s

表2 iICA 钙化的单因素分析Tab.2 Univariate analysis of intracranial internal carotid artery calcification ±s

注：表中仅列出iICA 钙化（±）或重度钙化（±）组间比较，P＜0.1 的变量；组间比较，*P＜0.1

年龄（岁）女性［例（%）］高血压［例（%）］糖尿病［例（%）］卒中史［例（%）］吸烟史［例（%）］体质指数（kg/m2）收缩压（mmHg）舒张压（mmHg）空腹血糖（mmol/L）甘油三酯（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）eGFR［mL/（min·1.73m2）］tHcy（μmol/L）T3［例（%）］钙化（-）（n=101)52.3±9.3 25（24.8）76（75.2）19（18.8）10（9.9）48（47.5）24.8±3.7 143.9±24.1 91.5±15.0 5.3（4.9，6.3）1.9±1.2 1.0±0.2 2.9±0.9 108.1±25.0 11.3（9.3，13.3）26（25.7）钙化（+）（n=327）64.1±9.9 115（35.2）272（83.2）122（37.3）56（17.1）110（33.6）24.0±3.4 147.3±23.2 88.2±13.6 5.6（5.0，7.2）1.7±1.1 1.1±0.3 2.7±0.9 101.9±28.2 11.3（9.3，14.8）116（35.5）χ2/t/Z 值10.65 3.80 3.20 11.95 3.09 6.39 2.05 1.31 2.02 2.32 2.37 2.75 1.18 2.42 0.93 3.30 P 值＜0.001*0.051*0.074*＜0.001*0.079*0.011*0.041*0.190 0.044*0.020*0.018*0.006*0.240 0.016*0.350 0.069*重度钙化（-）（n=321)59.1±10.6 102（31.8）249（77.6）90（28.0）40（12.5）125（38.9）24.2±3.4 144.6±23.1 89.3±14.2 5.4（4.9，6.8）1.7±1.0 1.1±0.3 2.9±0.9 104.4±26.8 11.1（9.3，13.8）95（29.6）重度钙化（+）（n=107）68.1±9.0 38（35.5）99（92.5）51（47.7）26（24.3）33（30.8）24.2±3.7 152.2±23.7 88.1±13.5 5.8（5.0，7.2）1.8±1.3 1.1±0.3 2.7±0.9 100.4±29.6 12.3（9.7，16.4）47（43.9）χ2/t/Z 值7.96 0.51 11.81 14.00 10.78 2.26 0.23 2.90 0.77 1.73 0.50 0.28 2.03 1.50 2.29 7.43 P 值＜0.001*0.475＜0.001*＜0.001*0.001*0.133 0.821 0.004*0.443 0.084*0.621 0.780 0.043*0.135 0.022*0.006*

表3 iICA 钙化危险因素的多因素Logistic 回归分析Tab.3 The risk factors for intracranial internal carotid artery calcification in multivariate logistic regression analysis

表4 iICA 重度钙化危险因素的多因素Logistic 回归分析Tab.4 The risk factors for intracranial internal carotid artery severe calcification in multivariate logistic regression analysis

3 讨论

血清同型半胱氨酸升高与动脉粥样硬化的发生密切相关，动脉钙化是动脉粥样硬化普遍存在的病理表现，研究［6-10］表明血清同型半胱氨酸水平升高与颅外颈动脉、冠状动脉和腹主动脉、脑动脉等动脉钙化发生率增加有关，然而涉及血清同型半胱氨酸与iICA 钙化的关系的研究并不多。由于动脉钙化往往伴随血管狭窄［12］、钙化引起血管顺应性降低［13］和下游微栓塞［14］，颅内动脉钙化与卒中人群死亡率升高和复发性血管事件相关［15-16］，因此，研究同型半胱氨酸与iICA 钙化的关系可为缺血性卒中的预防和治疗提供更多的依据。本研究通过容积积分的钙化评估方式探讨了iICA 钙化的危险因素，重点关注了血清总同型半胱氨酸与iICA 钙化的相关性。

本研究显示，76.4%的急性缺血性卒中患者存在iICA 钙化，和CHUNG 等［17］研究报道的iICA 钙化率相近（76.7%），iICA 钙化尤其是海绵窦段钙化在卒中人群中非常普遍，其钙化情况能在一定程度上反映脑动脉粥样硬化状态。多因素Logistic回归分析表明年龄、糖尿病史是iICA 钙化的独立危险因素，这和部分研究结果一致［18-19］。随着年龄增大，人体组织器官衰退，生理功能下降，钙物质的摄取和吸收减少致血钙浓度下降和骨骼钙游离入血，钙沉积于血管壁从而引起血管钙化［20］。糖尿病可通过启动骨形态发生蛋白、晚期糖基化终产物/晚期糖基化终产物受体、骨保护素/核因子κB 受体等相关信号转导通路调控血管钙化［21］。本研究跟既往以脑动脉为研究目标的研究结果不同的是，其他因素如高血压病不是iICA 钙化的独立危险因素［22］，原因可能是研究人群和目标动脉不同、样本量较小造成假阴性结果有关。

血清tHcy 三分位组间对比，iICA 钙化积分、重度钙化患病率呈上升趋势。在校正年龄、血压和血管危险因素后，结果提示tHcy 可能与iICA 钙化独立相关，尽管这种关联没有统计学意义。当以钙化积分四分位组中最高组为分界点定义重度钙化时，除年龄、糖尿病、收缩压外，tHcy 与iICA 重度钙化独立相关。本研究的结果与一些以颅外颈动脉或脑动脉为目标动脉的研究结果相似。一项研究［7］发现，通过颈动脉超声测量颅外颈动脉斑块钙化和颈动脉内膜中层厚度评估颈动脉粥样硬化，同型半胱氨酸与颅外颈动脉斑块钙化评分独立相关。另外一项通过CTA 评估脑动脉粥样硬化负荷的研究［6］表明，同型半胱氨酸水平升高与进展性脑动脉粥样硬化和进展性脑动脉钙化独立相关。同型半胱氨酸致动脉粥样硬化的机制可能与促进血管平滑肌细胞增殖、损伤血管内皮细胞和促进内皮细胞凋亡、引起氧化应激等多种作用有关，同型半胱氨酸在动脉粥样硬化斑块中可通过刺激间充质干细胞和单核细胞促进平滑肌钙化，增强成骨细胞分化的能力［8］，这部分解释了同型半胱氨酸与动脉粥样硬化钙化的关联。有体外血管钙化模型实验研究［23］提示氧化反应参与同型半胱氨酸促钙化过程，同型半胱氨酸呈剂量依赖性促进钙化的牛主动脉平滑肌细胞钙沉积，但对正常牛主动脉平滑肌细胞无钙化促进作用，提示同型半胱氨酸是钙化的促进因子而非启动因子。另外有高蛋氨酸饮食诱导高同型半胱氨酸血症的动物实验［24］证明，当血管钙化并发高同型半胱氨酸血症时大鼠血管的钙含量增加，同型半胱氨酸可通过加重脂质过氧化反应促进血管钙化，但单独高同型半胱氨酸血症并不使大鼠血管中的钙含量增加，这表明同型半胱氨酸水平升高可以促进血管钙化但不直接引起钙化，这或许是本研究多因素分析中tHcy 与iICA 钙化的相关性没有统计学意义但与重度钙化独立相关的可能解释之一。

本研究为回顾性分析，存在选择偏倚，仍需前瞻性研究进一步证实。由于纳入多因素回归的变量较多，虽然研究样本量符合统计一般经验要求，但依然不够充足，需要扩大样本量进一步证实。此外，由于不常规检测血管钙化的危险因素血钙、血磷，所以本研究并未校正这些因素的影响。

总之，本研究表明血清总同型半胱氨酸与iICA 钙化存在相关性，血清总同型半胱氨酸可能是iICA 重度钙化的独立危险因素，而血管钙化是一个与骨形成相似的具有高度可调控、可逆转、可预防的病理过程，今后有必要进一步研究能否通过调节血清总同型半胱氨酸水平来预防或缓解血管钙化从而降低缺血性卒中的发生率和复发率，为缺血性卒中的二级预防提供更多依据。