单采血小板来源外泌体的提取与鉴定

程 福，杨 璐，李小飞，陈 洁，杨 鑫，黄远帅，汪德清

（1.西南医科大学附属医院输血科，四川 泸州646000；2.中国人民解放军总医院输血科，北京100853）

外泌体是一种由多种细胞分泌的纳米级囊泡结构，直径约为30～150 nm，电镜下常呈球状或杯状，广泛存在于细胞上清，血浆、血清、尿液等体液中［1-2］，其胞内富含蛋白质、脂质、mRNA、miRNA等物质，是细胞间进行物质、信息交换的良好介质［3］。正常生理条件下，循环血液中血小板来源的微粒约占所有微粒成分的70%～90%［4］，且随着成分输血成为肿瘤患者治疗的重要手段，特别是血小板输注在预防和治疗肿瘤患者出血中发挥了重要作用，因此，开展血小板来源外泌体相关研究具有很重要的意义。因此，我们在本研究中着重探讨不同保存时间和保存方式对单采血小板来源外泌体提取、鉴定的影响，以便为后续进一步开展血小板来源外泌体研究提供稳定可靠的方法。

材料与方法

1 实验材料

超速离心机（美国Thermo Scientific公司）；离心水平转头（美国Thermo Scientific公司）；透射电镜（日本JEOL公司）；全能型化学发光成像系统（美国BIORAD公司）；血小板震荡仪（美国Forma Scientific公司）；0.22μm filter（美国Millipore公司）；BCA蛋白质定量试剂盒（Solarbio公司）；CD9单克隆抗体、β-actin内参、二抗、（Bioworld Technology公司）。

2 样本来源

单采血小板来自中国人民解放军总医院2017年12月献血员标本，检验合格后于血小板震荡仪上22℃震荡保存，备用。

3 样本处理

选取当天采集的某一单采血小板样本，均分于四个血小板保存袋中，标为A、B、C、D。A袋样本在血小板震荡仪上放存1天后即刻提取其外泌体；B袋样本在血小板震荡仪上放存5天后即刻提取其外泌体；C袋样本在血小板震荡仪上放存5天后，离心去掉血小板（2000g，30min，4℃），放-80℃冻存1周后提取其外泌体；D袋样本在血小板震荡仪上放存5天后，离心去掉血小板，混入5% DMSO放-80℃冻存1周后提取其外泌体。

4 外泌体提取

取30mL血小板样本于离心管，4℃，2000g，离心30min，去除大部分血小板；转移上清至新的离心管中，4℃，10000g，离心30min，去除残余血小板；转移上清至新的离心管中，4℃，105000g，离心2h，弃掉上清，并用1mL PBS重悬沉淀；0.22μm滤膜过滤上一步沉淀重悬液，并用PBS补足液体至离心管总体积，4℃，105000g，离心2h；弃掉上一步上清液，并用300ulPBS重悬沉淀，-80℃保存。

5 外泌体鉴定

5.1 透射电镜检测外泌体形态及大小 取分离提取的外泌体各20μL重悬液于塑料薄膜上，将铜网（芳华膜）倒扣在液滴表面，静置10min，用滤纸缓慢吸干液体，转移铜网至1%戊二醛液滴上负染5min，用滤纸缓慢吸干液体并用双蒸馏水液滴洗涤铜网3次，3min／次，再用滤纸缓慢吸干铜网上液体并将其置于白炽灯下照射10min左右以使铜网表面液体充分干燥，转移铜网至样品杆上样区，并于-80KV透射电镜下观察。

5.2 免疫印迹法验证 取分离提取的外泌体各20μL，加入等体积的RIPA细胞裂解液（含1%PMSF），冰上裂解30min，12000rpm离心5min，取上清液加入适量的4×蛋白上样缓冲液，煮沸10min；取处理后外泌体样本各10μL于12%SDS-PAGE凝胶上电泳（先80V恒压电泳30min，再120V恒压电泳约1h），结束后转移蛋白至PVDF膜上，并200mA恒流转膜80min，转膜结束后，用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2h，再加入CD9（1∶1000）单克隆抗体、β-actin，4℃摇床过夜。TBST洗膜4次，10min／次，再加入二抗（1∶5000），摇床上孵育1h，再TBST洗膜4次，10min／次，加适量ECL化学发光液于膜上，并用全能型化学发光成像系统分析。

5.3 外泌体总蛋白浓度测定 外泌体富含蛋白质，蛋白质分子中的肽键结构在碱性环境下能与Cu2+生产络合物，并将Cu2+还原成Cu+，而BCA试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色的复合物，并在562nm处有最大光吸收值，该复合物颜色与蛋白质浓度成正比，可根据光吸收值的大小来测定蛋白质含量，从而间接反映各实验组的外泌体产量高低。具体操作方法为：取分离提取的外泌体各20μL，并分别加入20μL RIPA细胞裂解液（含1%PMSF），冰上裂解30min，12000rpm离心5min；分别取25μL新鲜配置的BSA标准液和处理后外泌体样本，加入到96孔板中；再每孔加入200μL新鲜配置的BCA工作液；加盖，37℃孵育30min；在562nm处检测各孔吸光度值；根据标准曲线计算外泌体样本中蛋白浓度。

结 果

1 不同保存时间的单采血小板来源外泌体

不同保存时间的单采血小板来源外泌体，结果见图1。

图2 比较不同样本保存方式对外泌体提取产量及鉴定的影响

讨 论

目前，外泌体的提取方法包括超速离心法、超滤法、免疫磁珠法、PEG-based沉淀法、ExoQuickTM试剂盒等［5-7］，其中以超速离心法最为常用。相比于试剂盒法、免疫磁珠法，超速离心法耗时费力、外泌体回收率不高，但其提取纯度可靠、提取量大，且操作简单、成本较低，因此，对于初次接触外泌体领域的研究者而言，超速离心法无疑可以作为首选。所以，本研究仅针对超速离心法提取单采血小板来源外泌体的影响因素做了相关探讨，而未对其他方法进行研究。

外泌体是一种可由多种细胞通过胞吐形式释放到细胞外环境的纳米级双层膜囊泡，其形态规则，常呈球状或杯状，且不同来源的外泌体通常存在特异性表达的蛋白，比如HSP70、HSP90热休克蛋白，及CD9、CD81、CD63四跨膜蛋白超家族等［8］，这些外泌体标志蛋白常被用来作为外泌体鉴定的依据，因此，外泌体的鉴定除了利用电镜观察直接观察形态、大小，通常还可以借助免疫印迹技术或者流式细胞仪检测其表面特异性表达蛋白。本研究中，我们首先利用透射电镜直接观察外泌体，然后借助免疫印迹技术进一步验证，结果提示镜下可观察到直径约30～150nm茶托状的双层膜囊泡，且免疫印迹法检测到外泌体特异性表达的CD9分子，这证实了本研究采用的超速离心法模式可有效提取到外泌体。

外泌体提取过程中，除了考虑纯度的影响因素，提取产量也是不容忽视的问题，为了探讨超速离心法提取外泌体过程中常常影响提取产量的因素，我们首先研究了不同保存时间对血小板来源外泌体的影响，结果发现保存5天的单采血小板的外泌体产量明显高于保存1天的单采血小板的外泌体产量，这可能是因为随着血小板保存时间延长，其释放的外泌体含量逐渐升高，与前期相关报道的结论相符合：即室温保存的单采血小板，随着保存时间的延长血小板活化增多，微粒释放增多［9］。

在实际科研工作中，冻存样本常常是一项必要的操作，但冻存处理标本是否会对外泌体提取、鉴定造成影响至今暂无报道。因此，本研究中，我们对同一标本分别进行未冻存处理、冻存处理、加入冻存保护剂后再冻存处理，结果发现，冻存处理标本会明显降低其外泌体提取产量，这可能是由于外泌体是双层膜囊泡结构，在冻融过程中可能会导致部分外泌体破裂，而超速离心法不易离心得到破碎后的外泌体，从而使得外泌体的提取产量有所降低，电镜观察结果也表明冻存标本的外泌体在镜下不易找到视野，且形态相对不典型，这也证实了冻存处理会对外泌体的形态造成一定影响。DMSO常常作为细胞冻存液的成分之一，且研究表明，向冰冻血小板中加入5%～6%的DMSO可一定程度上保护血小板，提高其质量［10］，因此，我们尝试向冻存的标本加入一定量DMSO，其结果发现加入5%DMSO后，其外泌体提取产量有所提高，且形态相对有所改善。

综上，本研究有效地建立了适用于血小板来源外泌体提取的超速离心法模式，且对影响外泌体提取产量和鉴定的常见因素做出了明确的评估，为后续开展血小板来源外泌体研究奠定了基础。