应用FITC系统建立雌二醇直接竞争化学发光免疫分析方法

潘国华

（北京北方生物技术研究所有限公司，北京100076）

雌二醇（estradiol，E2）分子式C18H24O2，在女性雌激素中是生物学活性最强的，主要是促进子宫内膜转变为增殖期以及促进女性第二性征的发育。女性体内雌二醇主要来源于卵泡、黄体、和胎盘，妊娠后母体和胎儿血液中的脱氢异雄酮（dehydroisoandrosterone，DHA）在胎盘组织内转化为E2和雌酮（E1）。男性雌二醇则主要来源于睾丸。在循环系统中的E2主要结合在性激素结合蛋白（sex hormone binding protein，SHBG）上，并在肝脏中代谢成水溶性硫酸脂和葡萄糖醛脂，再经肾脏从尿液中排出体外。血清E2浓度是检查下丘脑-垂体-生殖腺轴功能的重要指标，对辅助检测某些内分泌及妇科疾病具有一定的临床价值。目前用免疫学检测雌二醇的主流方法包括放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法等，反应原理也有直接法与间接法两类。本工作是利用抗-FITC与FITC标记抗体形成桥接模式，以微孔板为载体，采取直接竞争一步法，构建了化学发光检测雌二醇的免疫检测方法，性能分析评估以及临床评价的结果都比较满意。

材料与方法

1 主要试剂与仪器

雌二醇单克隆抗体（Anti-E2Mab）与雌二醇-牛血清白蛋白（E2-BSA）购自Biospacific，辣根过氧化物酶（HRP）货号P8375、雌二醇（E2）货号E8875、异硫氰酸荧光素（FITC）货号F7250购自Sigma-Aldrich，白色不透明化学发光板购自ThermoFisher Scientific，新生牛血清、牛血清白蛋白（BSA）均购自兰州民海生物工程有限公司，其它化学试剂为国产分析纯，血清样本由北京中同蓝博临床检验所提供。化学发光仪200S为厦门天中达生物科技有限公司生产。

2 方法

2.1 FITC偶联BSA与E2Mab 参考李铮［1］的方法并略作改变，FITC溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，逐滴加入用碳酸缓冲液配制的蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，G25分离收集蛋白峰。分光光度计扫描，通过A495／A280计算偶联比，最终用于免疫的FITC-BSA偶联比为6∶1（F／P），用于免疫分析的FITC-E2Mab的偶联比为3∶1（F／P）。

2.2 兔抗FITC抗体的制备 FITC-BSA用弗氏完全佐剂混合乳化后，多点注射免疫新西兰兔，2周一次，共5次，ELISA测定抗体效价约为1∶10万。辛酸-硫酸铵法进行多克隆抗体纯化，0.02M PBS透析，-15℃以下保存。

2.3 辣根过氧物酶标记E2-BSA的制备 改良过碘酸钠法，HRP中滴加NaIO4进行活化，加入E2-BSA于碱性条件下反应，NaBH4中止反应，透析后加入等体积甘油，在-15℃以下保存。E2-BSA与HRP的质量比为1∶2。

2.4 预包被板的制备 将兔抗FITC抗体用0.02mol／L PB（pH7.4）稀释至5μg／mL，100μL／孔，4℃放置过夜，弃去包被液。将FITC-E2Mab用0.02mol／L PB（pH7.4）、1% BSA、10%蔗糖溶液稀释至不同工作浓度，100μL／孔，4℃放置过夜，弃去液体，拍干，在湿度低于30%条件下自然晾干。

2.5 校准品的制备 将雌二醇纯品用乙醇溶解为10μg／mL，再用100%去激素血清稀释为50、200、500、1000、3000pg／mL，作为校准品。标识为S1～S5，S0为100%去激素血清。

2.6 免疫分析程序 每孔加50μL校准品或样本、酶结合物50μL于预包被板，37℃孵育1h。用洗涤液洗板5次，加1∶1预先混合发光底物100μL，室温避光5min，测定发光值（RLU）。采用logit-ln模型进行直线拟合。方程为：log（Y）＝Alog（X）+B，Y为百分结合率，由Y＝（Bi／B0）／（1-Bi／B0）计算而得。

结 果

1 工艺的优化

1.1 E2特异性抗体（FITC-抗-E2）的预包被浓度、酶结合物稀释比例的选择

参考贺敏［2］的免疫试剂浓度选择的方法。当兔抗-FITC抗体（二抗）的包被浓度为5μg／mL时，选取FITC-抗-E2（一抗）的预包被浓度和HRP-E2-BSA稀释比例为考察因素，每个因素拟定3个水平，进行交叉实验。分别考察校准曲线的线性和空白检测限，结果如表1所示，各因素各水平的均值如表2所示。考察线性时，A因素（一抗预包被浓度）的K2值最大，B因素（酶结合物稀释比例）的K2值最大；考察最低检出限时A因素的K1最小，B因素的K2最小。A2B2组合线性最优且最低检出限与A1B2相差不大。综合二者考虑，免疫试剂最佳工作浓度为一抗的预包被浓度为20 ng／mL，酶稀释比例为1∶20000。按以上条件，校准曲线︱R︱为0.9990，空白检测限为4.8pg／mL。

表1 免疫试剂浓度的选择

表2 各因素水平的均值比较

1.2 酶结合物缓冲体系的选择

用0.02mol／LPBS（pH7.4）分别配制含20%小牛血清稀释液（A）和含1% BSA稀释液（B）。用以上两种稀释液分别配制工作浓度的酶结合物。分别考察与二抗板（只进行了二抗的包被，未进行E2特异性抗体的包被）的非特异性结合，以及37℃7天的加速热稳定性。考察非特异结合时，A、B稀释液的非特异性结合率（使用二抗板时的S0的光子数与一抗预包被板S0光子数的比值）均小于0.01%，表现均较好。将两种稀释液配制的酶结合物置于37℃7天后，分别与4℃保存的试剂进行对比实验。计算37℃试剂与4℃试剂实验的各校准品点RLU偏差百分比，结果如表3所示，A稀释液的稳定性好于B。

表3 两种稀释液热稳定性对比

2 反应时间选择

本分析采用一步法，对比分析20、40、60、100、120min对发光值的影响。由图1可以看出37℃孵育60min，反应即可达到平衡。

图1 反应时间的选择

3 性能指标评价

3.1 校准品曲线及空白检测限

同时测定20孔S0，计算RLU的均值x，和标准差s，以为Y值，代入校准品曲线公式，计算出相对应的的浓度值为4.8 pg／mL，即为本方法的空白检测限。

3.2 定量检测限

将浓度为50pg／mL的校准品用去激素血清依次稀释为40、30、20、10、5pg／mL，分别进行10孔重复测试，TE%＝｜相对偏倚｜+1.96CV%，各浓度的TE%分别为12%、21%、35%、46%、52%。以TE%不超过30%为定量检测限，定量检测限为30pg／mL。

3.3 线性

将一份已知浓度为3032ng／mL的雌二醇高值样本用校准品稀释液倍比稀释，其中最大稀释比例为1／100，浓度约30.32。样本稀释曲线如图2所示，E2样本的稀释度与本方法测定值得相关方程Y＝3069X，r＝0.9982，表明在本方法在30～3000 pg／mL范围内的线性关系良好。

3.4 回收率

将浓度为1900pg／mL的雌二醇样品（A）分别加入到41pg／mL、462pg／mL的血清样本（B）中，加入比例为1：9，测定值分别为213pg／mL、604pg／mL。根据公式R＝［C×（V0+V）-C0×V0］／（V×CS）×100%计算回收率分别为92.7%、99.1%，平均回收率为95.9%。（式中：R—回收率；V—样品A液的体积；V0—样品B液的体积；C—样品B液加入A液后的检测浓度；C0—样品B液的浓度；CS—样品A液的浓度。

3.5 分析特异性

配 制100ng／mL雌 三 醇、100ng／mL孕 酮、100ng／mL睾酮，测定结果为0.10ng／mL、0.07ng／mL和0.03ng／mL，交叉反应率分别为0.1%、0.07%、0.03%。根据人血清内甾体激素的含量，雌三醇、孕酮、睾酮浓度的变化，不影响雌二醇测定结果的分析。

3.6 分析内精密性与批间精密性

取低中高3份样本，在1次实验中平行测定10孔，计算分析内精密度；用3批试剂重复分析内精密度实验，用30孔的测量结果计算批间精密性。结果如表4、表5所示。分析内平均变异系数为5.6%，分析间平均变异系数为8.7%。

表5 分析间精密度（n＝30，pg／mL）

3.7 稳定性实验结果

使用37℃保存7天、4℃保存12个月的试剂盒、新制备试剂盒，同时进行测试10份浓度不同样本，结果如表6所示，稳定性试验的试剂计数均有下降，相关系数及测值偏差可以接受，使用配对t检验，P均＞0.05，表示测值差异无统计学意义。

表6 稳定性实验结果

3.8 临床比对结果

使用雌二醇全自动化学发光试剂（Beckman Coulter，Inc.）与本方法同时测定164份样本的雌二醇浓度，二者相关性如图3，相关性方程为Y＝0.862 X+26.084，r＝0.979。

图3 两种试剂盒样本测定结果的相关性

根据相关性方程计算本方法与贝克曼在不同浓度的测值相对偏倚，结果见表7。

表7 本方法与贝克曼试剂测值的相对偏倚

本方法与贝克曼试剂测定结果用EXCEL进行配对t检验，t＝0.01，P＞0.05，两者差异无统计学意义。

讨 论

小分子的检测是临床免疫检验的一个难点，除了高亲和力的抗体、合适位点的人工抗原［3］外，其反应模式的设计也非常耗费精力。小分子的基本反应模式可分为直接竞争法与间接竞争法［4］，直接竞争法是用辣根过氧化物酶标记抗原［5-6］，间接竞争法则是将人工抗原固定于固相载体［7-8］。一般而言直接竞争法反应更迅速，但两种方法的灵敏度高低则没有固定的规律。在两种基本的竞争模型上，还可以应用二抗、荧光素、生物素等构成多级联动反应，以获得更好的效果。

异硫氰酸荧光素（FITC）-抗-FITC在免疫检测中有不少成功的应用［9］。陈茶［10］等应用抗-FITC包被固相，FITC标记抗原，建立非均衡竞争雌二醇化学发光法。本文利用FITC进行二次包被抗体，可以有效减少空间位阻，通过两层包被，特异性抗体远离固相载体，其与小分子抗原、酶标记抗原的反应受到微孔板的干扰小，结合速率更快，对小分子与酶标记抗原的识别更趋向一致，从而检测效果更好。此外还可以提高E2单克隆抗体的包被效率。一般物理包被单克隆抗体的利用率在30%左右，而每个IgG分子有86个赖氨酸残基，可以结合多个FITC分子，再通过免疫反应连接到抗-FITC上，单抗利用率在80%左右，有效节约成本。

本方法构建的试剂盒，检测范围内线性关系良好，空白检测限4.8pg／mL，定量检测限30 pg／mL，与雌三醇、睾酮、孕酮均无明显交叉反应，与进口全自动化学发光试剂同时测定164份样本，二者测定结果的相关系数为0.979。反应仅需1小时，能够满足批量快速检测的市场需求，在临床检验工作中具有一定的应用价值。