RNA干扰TAGLN2基因对TGF-β1诱导心肌细胞凋亡的影响

方昱 张庆斌 许恩文 范新俊 孙丽娜 成威

(安徽省第二人民医院心血管内科，安徽 合肥 230041)

心肌细胞凋亡贯穿于心血管疾病发生发展的整个过程〔1〕，抑制心肌细胞的凋亡对于心血管疾病的治疗具有重要意义。转化生长因子(TGF)-β1是一种可对细胞生长进行调控的细胞因子，参与细胞增殖凋亡、免疫调节、胚胎发生等过程，目前已有多项研究表明TGF-β1可诱导心肌细胞凋亡〔2，3〕，TAGLN2是钙结合蛋白calponin家族的一个成员，与细胞的迁移、分化、组织浸润及胞外基质重塑等生物学行为存在密切关系，近些年已证实在膀胱癌、食管癌等多种肿瘤中TAGLN2呈高表达，其表达可影响细胞增殖、迁移和侵袭等〔4，5〕。TAGLN2在心血管方面的研究较少，有研究发现，TAGLN2在心肌梗死心力衰竭大鼠心肌组织中表达升高，miR-133a可通过抑制TAGLN2降低心肌细胞凋亡〔6〕，但TAGLN2对心肌细胞凋亡的机制研究尚未明确。本研究通过RNA干扰(RNAi)技术抑制TAGLN2表达，观察TAGLN2表达抑制后对TGF-β1诱导H9c2心肌细胞凋亡的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 大鼠H9c2心肌细胞购自中国科学院上海细胞研究所细胞库。TGF-β1、2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)探针均购自美国Sigma；膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒购自南京凯基；TAGLN2、p53、裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)3、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、核因子(NF)-κB p65和IκB-α抗体均购自美国CST；流式细胞仪购自美国BD。

1.2 细胞培养 H9c2心肌细胞在DMEM培养基〔含10%胎牛血清(FBS)、青链霉素双抗及200 mmol/L L-谷氨酰胺〕中，于37℃、5% CO2及饱和湿度培养箱中培养，细胞达80%生长汇合度时传代。将生长至对数期的细胞制备成单细胞悬液。

1.3 分组及转染 H9c2心肌细胞分为空白对照组、NC组、TGF-β1组和TGF-β1+si-TAGLN2组。空白对照组细胞不经特殊处理，NC组转染无干扰作用的阴性对照siRNA，TGF-β1组转染阴性对照siRNA后用20 ng/ml TGF-β1处理24 h，TGF-β1+si-TAGLN2组转染靶向抑制TAGLN2表达的siRNA后用20 ng/ml TGF-β1处理24 h。siRNA的转染参照LipofectamineTM2000(美国，Invitrogen)说明，转染前1 d以3.6×105个/孔密度接种H9c2心肌细胞于6孔板，细胞达80%～90%生长密度时将制备的siRNA-Lipo2000混合物转染细胞，转染24 h，收集细胞。

1.4 Western印迹 适量放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液提取细胞总蛋白，蛋白定量后经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，电转聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉封闭转好的PVDF膜2 h，洗膜，加入均按照1∶1 000稀释好的TAGLN2、p53、 Cleaved caspase3、Bcl-2、PI3K、 p-AKT、NF-κB p65和IκB-α抗体，4℃摇床孵育过夜，加入1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1.5 h，电化学发光(ECL)显色。GAPDH作为内参蛋白，通过Quantity软件分析各蛋白条带灰度值。以目的蛋白与内参蛋白灰度值比值为各蛋白相对表达量。实验重复3次。

1.5 细胞凋亡检测 收集各处理至规定时间的细胞，制备成105/ml浓度的单细胞悬液，预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，1倍结合缓冲液500 μl重悬细胞，分别加入AnnexinV-FITC 5 μl和PI 10 μl，充分混匀，避光室温反应20 min，上机前再加入300 μl 1倍结合缓冲液，1 h内通过流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.6 细胞活性氧(ROS)水平检测 收集各处理至规定时间的细胞，将细胞悬浮在含终浓度为10 μmol/L的DCFH-DA无血清培养液中，37℃孵育20 min，流式细胞仪检测DCF的荧光强度。由于ROS探针DCFH-DA无荧光，但可以穿过细胞膜将无荧光的DCFH氧化为带有荧光的DCF，因此对DCF的荧光强度检测可以间接反映细胞内ROS水平。实验重复3次。

1.7 统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1 si-TAGLN2转染H9c2心肌细胞效果 3组TAGLN2蛋白表达差异有统计学意义(F=69.560，P=0.000)。si-TAGLN2组TAGLN2表达(0.066±0.009)显著低于空白对照组(0.368±0.044，P<0.05)，而NC组(0.389±0.047)与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

图1 si-TAGLN2转染H9c2心肌细胞效果

2.2 si-TAGLN2对H9c2心肌细胞凋亡的影响 3组细胞凋亡率差异有统计学意义(F=140.871，P=0.000)。TGF-β1组细胞凋亡率(31.11%±3.26%)显著高于NC组(3.86%±0.32%，P<0.05)，TGF-β1+si-TAGLN2组(12.24%±1.31%)显著低于TGF-β1组(P<0.05)。见图2。

图2 si-TAGLN2对H9c2心肌细胞凋亡的影响

2.3 si-TAGLN2对H9c2心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响 与NC组比较，TGF-β1组细胞Bcl-2蛋白表达显著降低，Cleaved caspase3和p53蛋白表达显著升高(P<0.05)；与TGF-β1组比较，TGF-β1+si-TAGLN2组Bcl-2蛋白表达显著升高，Cleaved caspase3和p53蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图3，表1。

图3 si-TAGLN2对H9c2心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响

组别Bcl-2Cleaved caspase3p53NC组0.524±0.0480.048±0.0070.104±0.010TGF-β1组0.113±0.0121)0.197±0.0231)0.678±0.0651)TGF-β1+si-TAGLN2组0.305±0.0342)0.066±0.0092)0.155±0.0162)F值105.61090.332198.299P值0.0000.0000.000

与NC组比较：1)P<0.05；与TGF-β1组比较：2)P<0.05；下表同

2.4 si-TAGLN2对H9c2心肌细胞ROS水平的影响 TGF-β1组细胞ROS水平(DCF荧光强度：67.74±3.22)显著高于NC组(25.65±1.83，P<0.05)，而TGF-β1+si-TAGLN2组(39.67±2.51)显著低于TGF-β1组(P<0.05)，且3组比较差异有统计学意义(F=206.524，P=0.000)。

2.5 si-TAGLN2对H9c2心肌细胞PI3K/AKT及NF-κB信号的影响 与NC组比较，TGF-β1组细胞PI3K、 p-AKT和IκB-α蛋白表达显著降低，NF-κB p65蛋白表达显著升高(P<0.05)；与TGF-β1组比较，TGF-β1+si-TAGLN2组PI3K、 p-AKT和IκB-α蛋白表达显著升高，NF-κB p65蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图4，表2。

图4 si-TAGLN2对H9c2心肌细胞PI3K/AKT及NF-κB信号的影响

表2 各组PI3K、 p-AKT、NF-κB p65和IκB-α蛋白表达比较

3 讨 论

细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡过程，异常的细胞凋亡与多种疾病的发生发展密切相关。心肌细胞的凋亡是心肌病中心肌细胞死亡的形式之一，其凋亡贯穿于心血管疾病发生发展的整个过程。TGF-β1是一种多功能的细胞因子，在心肌梗死、心肌肥厚等心血管疾病中急剧增加，一些转录激活因子也可上调TGF-β1在大鼠心肌细胞的表达，而TGF-β1的分泌又可作用于心肌细胞自身，通过调控一些信号通路诱导心肌细胞的凋亡〔7，8〕。已有多项研究表明心肌细胞在TGF-β1的刺激下可发生凋亡〔2，3〕。TAGLN是一种肌动蛋白结合蛋白，主要在平滑肌细胞中存在，在维持细胞运动、调节细胞骨架等过程中有重要作用。有研究发现，miR-133a可通过靶向抑制TAGLN2介导缺氧诱导的心肌细胞凋亡〔9〕。由于RNAi技术是一种可在转录后阻断目的基因表达的新技术，在基因功能研究、疾病治疗等方面应用广泛〔10〕，本研究中使用RNAi技术抑制H9c2心肌细胞TAGLN2表达，发现TAGLN2表达的抑制可明显降低由TGF-β1诱导的心肌细胞凋亡。

细胞凋亡受分子水平调控，Bcl-2家族、caspase家族及p53在细胞凋亡过程中均发挥重要作用。研究表明，多种心血管疾病中Bcl-2的表达下调，caspase3、p53表达上调，从而可引起心肌细胞凋亡，而上调Bcl-2表达及下调caspase3和p53表达可对心肌细胞凋亡起抑制作用〔11，12〕。本研究结果表明，TAGLN2表达的抑制对心肌细胞凋亡的调节方式是上调Bcl-2及下调Cleaved caspase3和p53表达。心肌细胞的凋亡还受PI3K/AKT、NF-κB信号的调控，PI3K/AKT信号是细胞内一条重要的信号途径，在细胞内发挥促细胞生存、抗凋亡等功能。研究表明，激活PI3K/AKT信号对多种因素诱导的心肌细胞损伤起保护作用〔13，14〕。NF-κB几乎存在于所有的真核细胞中，对细胞凋亡具有调节作用。研究表明，在多种心血管病中，NF-κB信号被激活，抑制心肌NF-κB活性及IκB-α降解可减少心肌细胞凋亡〔15，16〕。本研究结果表明，TAGLN2表达的抑制可通过激活PI3K/AKT信号及抑制NF-κB信号降低TGF-β1诱导的心肌细胞凋亡。此外，氧化应激(OS)也已被证实可诱导多种培养的细胞发生凋亡，也被认为是多种细胞凋亡的共同介质，OS产生的ROS可作用于信号分子而介导细胞凋亡〔17，18〕。研究表明，在TGF-β1、高糖等诱导的心肌细胞凋亡过程中ROS水平升高，可介导心肌细胞凋亡〔19，20〕。

综上，TAGLN2表达的抑制可降低心肌细胞凋亡，机制可能与降低细胞内ROS水平、激活PI3K/AKT信号和抑制NF-κB信号有关，对凋亡的作用方式是上调Bcl-2及下调Cleaved caspase3和p53表达。