辛伐他汀延缓生酮饮食导致的骨量丢失的实验观察

杨舟 刘祺 许晓林 刘雅普 吴秀华 黄志平 黄祖成 孔刚刚 丁建羊 朱青安

南方医科大学南方医院脊柱骨科，广东 广州 510515

生酮饮食(ketogenic diet，KD)是一种高脂肪、低碳水化合物的配方饮食，可将机体从糖代谢转变为脂肪氧化供能，增加酮体代谢，目前在临床上是治疗儿童耐药性癫痫的手段之一[1]，也对急性和退变性神经系统疾病和急性脊髓损伤等具有治疗作用[2]。然而，Hahn等[3]于1979年首次报道生酮饮食相关性骨量丢失，也有研究发现儿童难治性癫痫的患者在长期使用生酮饮食干预后发生骨量丢失[4]。本课题组前期研究证实了生酮饮食导致小鼠骨量丢失、力学性能下降[5]。因此由于生酮饮食在临床上的应用而导致骨量丢失的不良反应不容忽视。

他汀类药物是3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A 还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMG-CoA) 的抑制剂，通过抑制胆固醇合成链中的限速酶HMG-CoA还原酶来减少胆固醇的合成。1999 年 Mundy 等[6]首次发现，他汀类药物有激活成骨细胞、促进骨合成代谢的作用。随后研究进一步发现，辛伐他汀能在体内和体外环境下通过提升骨形态发生蛋白2和碱性磷酸酶的表达水平刺激骨形成，还可以刺激骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[7-8]，可能成为新的有效的治疗骨质疏松症的药物。然而辛伐他汀对于生酮饮食引起的骨质疏松症的治疗未见报道。

本研究目的是通过分析股骨远端松质骨和中段皮质骨的骨微结构、生物力学性能以及骨形态的改善等评价辛伐他汀对生酮饮食引起的骨质疏松症的治疗作用。

1 材料和方法

1.1 动物模型与分组

40只雌性8周龄C57BL/6 J小鼠，购自南方医科大学实验动物中心，平均体重为16～18 g。适应性喂养1周后随机分为5组，分别为对照组(Sham)、卵巢切除组(OVX组)、卵巢切除加辛伐汀干预组(OVX+ST组)、生酮饮食组(KD组)、生酮饮食加辛伐他汀干预组(KD+ST组)。OVX和OVX+ST组小鼠在异氟烷麻醉下行双侧卵巢切除术，方法参照以往研究[9]。KD及KD+ST组小鼠予以碳水化合物与脂肪比为1∶3的生酮饮食(Zeneca，深圳，广东，中国)喂养，而Sham组、OVX组、OVX+ST组喂以普通饮食(购自南方医科大学实验动物中心) (两种饮食基本营养素含量见表1)。辛伐他汀治疗组小鼠予以辛伐他汀20 mg/(kg·d)灌胃，方法参照以往研究[10]。12周取材，获取血清及双侧股骨，左侧股骨置于-80 ℃保存备用，右侧股骨置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h备用。

表1 普通饲料与生酮饮食成分Table 1 Basic nutrient content in SD and KD

1.2 体重、血酮、血糖和子宫重量的测量

干预12周后，用CS 200电子称(Ohaus Pine Brook NJ 美国)称量小鼠体重。采用剪尾法获取小鼠血液标本，并用血糖仪(JPS-5 怡成 北京 中国)、血酮仪(Meter T-1 Sentest Inc. 台湾 中国)测量血糖和血酮。过量麻醉处死小鼠，仔细分离子宫后，于4 ℃冰箱生理盐水中浸泡备用，纱布吸干生理盐水后称重。

1.3 显微CT扫描

对所有小鼠的右侧股骨行显微CT(μ80 Scanco公司瑞士)扫描。预扫完毕后分别选择股骨远端1/3的部位和股骨中段180层作为扫描区域。扫描参数为电压55 kV，电流145μA，层厚为12 μm。扫描结束后，以股骨髁消失作为第一层选取100层分析松质骨显微结构，测量总矿物质密度(TMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁连接密度(Conn.D)等。测量股骨中段的100层皮质骨的厚度(Ct.Th)、皮质骨总面积(Tarea)、皮质骨横截面面积(Barea)。

1.4 股骨远端松质骨压缩试验

通过有限元模型分析软件(SCANCO Medical AG，版本1.13)，采用高分辨率骨微结构的三维图像建立股骨远端松质骨压缩的有限元模型，在线弹性范围内进行轴向压缩仿真试验，按同质和各向同性的弹性材料来模拟。其中骨材料的参数分别为泊松比ν=0.3，杨氏模量E=10 000 MPa，方法参照以往研究[11]。采用“Z轴方向高摩擦压缩试验”模拟股骨压缩试验，计算股骨远端松质骨压缩刚度。

1.5 股骨中段三点弯曲试验

左侧股骨标本在室温下解冻1 h后，采用电磁伺服材料试验机(E1000 Instron公司 美国)进行股骨三点弯曲试验。具体方法如下：采用游标卡尺确定股骨的中点，将股骨放置于自制的三点弯曲平台上，支架的跨距为10 mm，两端支架到股骨中点的距离为5 mm，以2 mm/min的速度在股骨中点向下横向施压至破坏(图1)。连续记录载荷和位移，从载荷-位移曲线中得到最大载荷、最大位移、刚度、最大能量吸收。

图1 股骨三点弯曲试验Fig.1 Three-point bending test for the femurs

1.6 股骨骨组织学分析

显微CT扫描后，右侧股骨置于10%EDTA脱钙4周后，自来水流水冲洗过夜，梯度乙醇脱水，石蜡包埋。每组标本行矢状面切片，厚度约5 μm，HE染色，在光学显微镜选40倍镜下观察骨小梁结构。

1.7 统计学处理

所得数据用均数±标准差表示。采用单因素方差分析评价体重、子宫重量、血糖、血酮、血钙、血磷、骨结构参数和力学参数。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 体重、子宫重量、血液指标

干预12周后各组间小鼠体重差异没有统计学意义。OVX组和OVX+ST组小鼠子宫重量分别为(0.04±0.01)g 和(0.03±0.01)g，明显低于Sham组(0.13±0.02)g，差异具有统计学意义(P<0.05)(表2)。

组别体重/(g)子宫重量/(g)Sham20.3±0.760.13±0.02OVX21.8±1.160.04±0.01∗OVX+ST20.3±1.280.03±0.01∗KD20.8±1.670.13±0.03KD+ST20.4±1.340.13±0.03

注：与Sham组相比，*P<0.05。

12周时KD组和KD+ST组血酮分别为(1.28±0.36)mmol/L和(1.48±0.53)mmol/L，均显著高于Sham组(0.60±0.32)mmol/L。而各组之间的血糖、血清钙或磷含量差异均没有统计学意义(表3)。

组别血酮/(mmol/L)血糖/(mmol/L)血钙/(mol/L)血磷/(mol/L)Sham0.60±0.327.25±1.032.20±0.102.36±0.28OVX0.75±0.177.33±0.992.17±0.132.29±0.26OVX+ST0.63±0.106.33±0.312.21±0.092.30±0.48KD1.28±0.36∗7.83±0.812.14±0.032.38±0.52KD+ST1.48±0.53∗6.25±0.682.12±0.132.10±0.36

注：与Sham组相比，*P<0.05。

2.2 股骨骨微结构

OVX组和KD组小鼠股骨远端松质骨的总矿物质密度(TMD)分别为(36.3±8.84)mg/cm3和(39.2±13.5) mg/cm3，明显低于Sham组(69.0±11.2) mg/cm3(P<0.05)。辛伐他汀治疗后，OVX+ST组TMD为(53.0±10.1) mg/cm3，较OVX组显著升高(P<0.05)。KD+ST组TMD为(51.8±6.20) mg/cm3，较KD组有所升高，但组间差异没有统计学意义(P>0.05)。骨小梁连接密度(Conn.D)的组间变化与TMD组间变化趋势相似。OVX+ST组股骨骨体积分数(BV/TV)显著高于对照组(4%与6%)，同样KD+ST组股骨骨体积分数也显著高于对照组(4%与7%)。各组间骨小梁数目的变化趋势与各组间的骨体积分数变化趋势相同，而各组间骨小梁分离度的变化趋势则相反(图2)。

图2 远端股骨骨松质Micro-CT扫描注：与Sham组相比，*P<0.05；两组间比较，#P<0.05。Fig.2 Micro-CT images and parameters of cancellous bone at the distal femurs

各组之间股骨中段皮质骨骨面积(Barea)或骨皮质厚度(Ct.Th)的差异没有统计学意义(P>0.05)。OVX+ST组股骨中段皮质骨总面积(Tarea) 为(1.77±0.10)mm2，明显高于OVX组(1.44±0.33)mm2(P<0.05)(图3)。

图3 中段股骨骨皮质Micro-CT扫描注：与Sham组相比，*P<0.05；两组间比较，#P<0.05。Fig.3 Micro-CT images and parameters of cortical bone at the middle femurs

2.3 股骨远端松质骨压缩试验

Sham组、OVX组、OVX+ST组、KD组和KD+ST组小鼠股骨远端松质骨刚度分别为(320±146) N/mm、(47±41)N/mm、(233±74)N/mm、(35±15)N/mm和(161±38)N/mm。OVX组和KD组与Sham组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。OVX+ST组刚度大于OVX组，且组间差异有统计学意义(P<0.05)。尽管KD+ST组刚度高于KD组，但组间刚度的差异没有统计学意义(图4)。

图4 有限元分析股骨远端松质骨压缩刚度注：与Sham组相比，*P<0.05；两组间比较，#P<0.05。Fig.4 The stiffness results of finite element analysis at the distal femurs

2.4 股骨中段三点弯曲试验

图5 股骨三点弯曲实验的力学参数注：与Sham组相比，*P<0.05；两组间比较，#P<0.05。Fig.5 Mechanical parameters of the three-point bending test for the femurs

Sham组、OVX组、OVX+ST组、KD组和KD+ST组小鼠股骨最大载荷分别为(12.4±1.4)N、(11.1±0.7)N、(17.1±0.8)N、(12.5±1.1)N、(19.4±3.0)N。OVX+ST组和KD+ST组与Sham组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，辛伐他汀治疗组显著高于对照组(P<0.05)。股骨最大位移、能量吸收、刚度三个指标OVX+ST组比OVX组、KD+ST组比KD组、OVX+ST组和KD+ST组都比Sham组有所升高，但是组间差异没有统计学意义(P>0.05)，而其中股骨最大能量吸收KD+ST组(2.46±0.73)mJ显著高于Sham组(1.33±0.37)mJ和KD组(1.00±0.17)mJ(P<0.05)(图5)。

2.5 股骨骨组织学分析

Sham组股骨远端骨骺板下见到的骨小梁结构排列紧密、有规则，小梁间连接成网状，骨小梁厚度较为一致。而OVX组和KD组骨小梁排列稀疏，总量明显减少，骨小梁间连接性差，出现大量骨小梁盲端。辛伐他汀治疗后骨小梁结构、骨小梁壁厚度、形态均较OVX组和KD组明显改善，结构比较成熟，接近对照组(图6)。

图6 股骨远端HE染色结果Fig.6 Histological images of the distal femurs with HE staining

3 讨论

本研究不仅观察辛伐他汀对KD骨量丢失的作用，同时也观察辛伐他汀对OVX骨量丢失的影响，较全面地评价辛伐他汀对KD骨量丢失的效应。本文还从显微CT和组织学两个方面观察了骨微结构的改变，分别采用有限元模型和三点弯曲试验评价了股骨远端松质骨和中段皮质骨的力学性能，从宏观和微观、结构和功能等多个层面来评价辛伐他汀缓解骨量丢失的作用。本文的结果表明在辛伐他汀干预后，由OVX和KD引起的股骨远端松质骨骨量减少得到了改善，股骨中段皮质骨也得到增加，股骨三点弯曲实验力学性能得到提升，说明辛伐他汀能够改善由卵巢切除和生酮饮食导致的骨质疏松症。

生酮饮食是一种以低碳水化合物而高脂为特点的饮食，用于治疗难治性癫痫已有近百年的历史，且它对心血管疾病的预防、神经损伤的保护甚至肿瘤的治疗也被越来越多的报道[12]。尽管KD被认为是相对安全的治疗方式，但是引起的不良反应却不容忽视，尤其在治疗小儿难治性癫痫时对骨的生长发育和代谢的影响[4]。我们前期研究发现了生酮饮食能诱导不同程度的骨量丢失、力学性能下降[5]，包括松质骨骨容量减少、间隔增宽、连接密度变低、骨小梁数下降、皮质骨厚度及刚度减弱等众多方面。本研究结果显示KD组较Sham组股骨远端松质骨的TMD、Conn.D、BV/TV、Tb.N降低而Tb.Sp增加，再一次验证了KD会引起小鼠骨量的丢失。

血钙、血磷与骨组织中的钙、磷保持动态平衡，血钙、血磷水平的测定能反映出骨组织的代谢情况。血钙和血磷在骨骼生长中具有重要的作用，血钙水平下降会导致破骨细胞活性的增加，引起骨骼中的钙被溶解，从肾脏流失，而血磷水平升高会引发骨吸收加速，最终导致骨质疏松症[13]。本研究中各组之间的血清钙或磷含量差异均没有统计学意义，故OVX和KD引起的骨骼系统的变化不是由于钙元素缺乏或血磷过高所引起。本研究股骨中段皮质骨KD组变化不大，与前期研究皮质骨厚度降低不一致，而其可能原因是两次研究所用的生酮饮食的配方不同，旧配方中钙元素含量偏低，而本研究用的生酮饮食中营养素含量符合美国营养学会(AIN93)大小鼠纯化型标准饲料标准，保证了钙、磷、维生素D的充足供应。

临床上治疗骨质疏松症主要包括防止骨质吸收和促进骨形成两种机制的药物，前者有激素替代疗法、选择性雌激素受体调节剂、双膦酸盐类，包括选择性雄激素受体调节剂、甲状旁腺素类似物、催产素类似物等[14]。然而对于已经出现骨量丢失或是骨质疏松的患者，促进骨形成的药物急需开发。辛伐他汀是3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂家族成员之一，通过抑制胆固醇合成链中的限速酶HMG-CoA还原酶，减少胆固醇合成，临床上主要用于治疗高脂血症[15]。Mundy 等[6]首次发现，他汀类药物有激活成骨细胞、促进骨合成代谢的作用，大量研究已经报道辛伐他汀可能通过促进成骨细胞分化影响骨的形成[16-17]，可干扰破骨细胞、前体细胞向多核破骨细胞的融和过程[18-19]等机制对骨质疏松有延缓改善的作用。本研究发现KD+ST组较KD组TMD、Conn.D、BV/TV、Tb.N有所增加而Tb.Sp下降，最大载荷、最大位移、能量吸收、刚度增高，辛伐他汀缓解了由生酮饮食导致的骨量丢失。除此之外，OVX+ST组和OVX组相比在上述指标的变化趋势相似，辛伐他汀同样缓解由卵巢切除导致的骨量丢失，结论与其他学者实验结论一致。

本研究发现了辛伐他汀对生酮饮食导致的骨量丢失的缓解作用，但是并没有研究不同剂量及不同时间点对生酮饮食所引起的骨质疏松的影响。其次，本研究仅观察到了辛伐他汀改善骨质疏松的现象，并没有涉及其作用的机制。

总而言之，生酮饮食能够诱导松质骨骨量丢失、生物力学性能下降，而辛伐他汀对于生酮饮食导致的骨量丢失和生物力学性能下降具有一定的缓解作用。