贵阳地区5 486例孕妇G6PD缺乏症基因突变筛查*

李頔， 卓召振， 王怡萌， 熊永红， 胡莉, 杨国珍， 黄盛文,***

(1．贵州医科大学 医学检验学院， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州省人民医院 检验科， 贵州 贵阳 550002)

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症是一种常见的遗传性酶缺陷疾病， 患者通常在感染或外源性氧化诱导物的作用下发生红细胞破裂，从而出现急性溶血性贫血、黄疸、血红蛋白尿、 乏力等症状，严重者可有胸闷、呼吸困难、休克和肾功能衰竭，威胁患者生命。G6PD缺乏症是新生儿黄疸的主要危险因素之一，患儿可发展为核黄疸，如治疗不及时可导致终生智力低下。因此，对孕妇进行G6PD缺陷症产前筛查，重点关注筛查阳性的孕妇，对可能患有G6PD缺乏症的患儿采取预防措施，防止核黄疸的发生。全球约有4亿人为G6PD缺陷症患者或携带者，主要分布在非洲、亚洲的热带区域，尤其以地中海沿岸和中东地区为主。 G6PD缺陷症我国主要分布在长江以南的区域，呈现“南高北低”的分布特点，以海南、广东、广西、云南、贵州、四川等省为高发[1]。为了解贵阳地区孕妇人群的G6PD缺乏症发生率及基因突变类型，本研究对就诊于贵州省人民医院的5 486例孕妇进行G6PD基因检测，结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象与材料

1.1.1研究对象 2017年6月～2018年6月在产科门诊进行孕期保健的的孕妇5 486例，21～45岁、平均(29.5±4.8)岁。孕妇填写产前筛查知情同意书。

1.1.2主要仪器与试剂 Lab-aid 820磁珠法全血DNA提取系统(厦门致善生物科技股份有限公司)，NDLite微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific)，SLAN96实时荧光PCR仪(上海宏石)，全血DNA快速提取试剂盒和G6PD基因突变检测试剂盒购自厦门致善生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1基因组DNA提取 用EDTA-Na2抗凝管采集孕妇外周静脉血2 mL，用Lab-aid 820磁珠法全血DNA提取系统提取基因组DNA，微量分光光度计测定提取的DNA样本的浓度和纯度。

1.2.2PCR扩增及熔解曲线分析 每份样本分两管进行检测，分别为G6PD PCR混合液A和G6PD PCR混合液B。PCR扩增采用25 μL的反应体系，向每只PCR薄壁反应管中加入DNA样本5 μL。PCR反应程序为50 ℃ 2 min→95 ℃ 10 min→[95 ℃ 15 s→65 ℃～56 ℃(每个循环下降1 ℃)15 s→76 ℃ 20 s]×10个循环→(95 ℃ 15 s→55 ℃ 15 s→76 ℃ 20 s)×50个循环，在55 ℃退火阶段采集FAM、HEX、ROX和Cy5通道荧光信号。在实时荧光PCR仪上进行熔解曲线分析，程序设置如下：95 ℃ 1 min→35 ℃ 3 min→40 ℃～85 ℃，以0.4 ℃/5 s的升温速率进行熔解曲线分析，在此阶段采集FAM、HEX、ROX和Cy5通道荧光信号。

1.2.3结果判读 按照试剂盒说明书，分别对A管和B管不同通道的熔解曲线进行分析，根据野生型对照样本和每个待测样本熔解峰的Tm值差值(ΔTm)判断样本是否有G6PD基因突变。A管和B管共检测12种突变类型，A管检测出c.1360C>T、c.1376G>T，c.1388G>T、c.871G>A、c.1004C>A和c.1024C>T，B管检测出c.95A>G、c.383T>C、c.392G>T、c.487G>A、c.592C>T和c.517T>C。

2 结果

2.1 G6PD基因突变筛查

对5 486例孕妇的12种G6PD基因突变类型进行检测，通过熔解曲线分析，每例均获得明确的G6PD基因型，共有184例检出携带有G6PD基因突变，筛查阳性率为3.35%。

2.2 G6PD基因突变类型

在184例 G6PD基因突变阳性孕妇中，共有15种基因型(表1)，其中杂合突变型10种、复合突变型4种、纯合突变型1种，分别为173例(94.02%)、10例(5.43%)和1例(0.54%)。在12种突变类型种共检出11种类型，按所占比例排列前5种突变类型依次是c.1388G>A(25.13%)、c.519C>T(21.03%)、c.95A>G(15.38%)、c.1024C>T(13.85%)和c.1376G>T(13.85%)，这5种突变类型共占89.23%，未检出c.1360C>T(表2)。

3 讨论

G6PD缺乏症属X连锁不完全显性遗传，其基因定位于Xq28。当女性两条染色体都带有致病基因，称为纯合子；仅一条X染色体带有致病基因，称之为杂合子。男性仅有一条X染色体，携带者称为半合子。女性纯合子和男性半合子常伴有严重的G6PD酶缺乏，症状较为严重，而女性杂合子的酶活性异质性较大，临床表现轻重不一。我国南方地区是G6PD缺乏症的高发区，但不同地区和人群的携带率差别较大。文献报道广东和广西的携带率分别为4.2%[2-3]和11.34%[4-5]，部分地区高达16%。本研究结果显示贵阳地区孕妇人群的G6PD基因携带率为3.35%(184/5 486)，低于贵州荔波苗族(7.68%)[6]、西江苗族(6.5%)[7]，江口土家族(7.49%)[8]和从江县侗族(6.49%)[9]的基因突变携带率，说明贵州少数民族的G6PD缺乏症发生率更高。目前，国内报道的G6PD基因突变类型有30多种，其中最常见的是c.1388G>A、c.95A>G和c.1376G>T。本研究的5种常见突变类型依次是c.1388G>A、c.519C>T、c.95A>G、c.1024C>T和c.1376G>T，占所有突变类型的89.23%，说明不同地区的常见突变类型有所差异。

表1 184例孕妇G6PD突变基因型Tab.1 G6PD mutant genotype in 184 pregnant women

表2 12种G6PD基因突变类型Tab.2 Gene mutation types of 12 kinds of G6PD

由于部分女性杂合子酶活性降低不明显，临床上常用的酶活性检测不能筛查出所有的女性纯合子，因此，采用分子筛查方法可有效检测出女性杂合子。本研究采用多色探针荧光PCR熔解曲线法可同时检出12种G6PD基因突变类型，由于其他少见和未知突变类型不在本方法的检测范围内，临床上仍然需要与酶活性检测相结合，并采用序列分析方法提高阳性检出率，或是采用高通量测序法对G6PD基因全长序列进行分析，避免少见和未知突变的漏检[10-11]。

文献报道，G6PD缺乏症的新生儿病理性黄疸发生率为33.3%，是正常新生儿的3.8倍[12]，尤其是女性纯合子和男性半合子发生率更高。在配偶正常的情况下，杂合子孕妇的新生儿中男性有50%是半合子，女性有50%是杂合子；纯合子孕妇的新生儿中男性全是半合子，女性全是杂合子。本研究筛查出杂合子孕妇173例、纯合子(包括复合突变型和纯合突变型)孕妇11例。对这些G6PD基因突变阳性的孕妇应及时提供遗传咨询和预防措施，并对新生儿及早进行酶活性或基因检测，可有效减轻 G6PD 缺乏症对新生儿造成的危害[13-14]。

本研究获得了贵阳地区孕妇人群G6PD 缺乏症的发生率和基因突变谱，为本地G6PD 缺乏症的遗传咨询和防控计划提供了有价值的遗传学资料。